專(zhuān)利名稱(chēng)：粘著箭菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及固氮菌和植物根際促生細(xì)菌粘著箭菌Ensifer adhaerens CGMCC 6315在鹽脅迫條件下提高黃豆發(fā)芽率的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物根際促生菌PGPR是ー類(lèi)具有促進(jìn)作物活力并增加產(chǎn)量，抑制植物病原菌、根際有害微生物的根際微生物。PGPR是生物肥料和生物農(nóng)藥的重要資源庫(kù)，其篩選、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用受到越來(lái)越多的重視。PGPR促進(jìn)植物活力的機(jī)制可分為直接和間接促進(jìn)作用兩種方式。直接促進(jìn)作用包括產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素、固氮作用、加 強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用(主要是鐵離子的利用和固態(tài)磷的溶解)等；間接促進(jìn)作用方式主要是PGPR能抑制植物病原菌的生長(zhǎng)及改善病原菌對(duì)植物的侵染條件，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。在直接促進(jìn)作用方式中，PGPR可提供外源激素而影響作物的生長(zhǎng)，ー些PGPR能產(chǎn)生IAA，改善受鹽脅迫的植物自身合成生長(zhǎng)素IAA的能力受到抑制的不利影響。PGPR還可通過(guò)產(chǎn)生嗜鐵素向植物提供鐵-嗜鐵素復(fù)合體，從而增加植物對(duì)鐵營(yíng)養(yǎng)的吸收。土壤鹽潰化對(duì)農(nóng)業(yè)的影響是ー個(gè)全球性的問(wèn)題，全球20%的耕地和近半數(shù)的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅，我國(guó)的鹽潰地總面積約I億公頃。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值時(shí)會(huì)破壞植物細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，使植株的生長(zhǎng)受到抑制，因而土壤鹽潰化造成土地產(chǎn)出率低，農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力嚴(yán)重不足，制約了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。申請(qǐng)人:篩選到ー株命名為T(mén)MX-23的菌株，該菌株具有固氮能力，基因組中有兩種不同的固氮酶還原酶基因(nifH)。該菌株產(chǎn)生吲哚こ酸、胞外多糖、嗜鐵素、水楊酸、2，3- ニ羥基苯甲酸、氰化氫和氨。TMX-23菌株被鑒定為粘著箭菌萬(wàn).adhaerens, TMX-23菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為=CGMCC 6315。目前尚未見(jiàn)有萬(wàn).aofeereas作為植物根際促生菌的研究報(bào)道。萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315菌株可用作PGPR菌劑，顯著提高鹽脅迫下的黃豆發(fā)芽率。該菌株可應(yīng)用于鹽潰地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，提高作物的活力和產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種具有固氮能力和具有PGPR活性的菌株，及其應(yīng)用于鹽脅迫條件下的黃豆發(fā)芽率的提高。本發(fā)明所提供的菌株為ー種粘著箭菌^'. at/Aaere/751,該菌株現(xiàn)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC 6315。其形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖I所示。該菌株的基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所不。本發(fā)明提供的^: adhaerens CGMCC 6315菌株具有固氮能力。如圖3所示，該菌株可在固氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從其基因組DNA中克隆獲得兩個(gè)固氮酶還原酶基因nifH(圖4泳道I中的條帶3和4)片段。DNA序列遺傳進(jìn)化樹(shù)分析(圖5)顯示這兩個(gè)nifH基因片段分別與及 sp. TJ170和藍(lán)細(xì)菌sp. MCC-3A的nifH基因的同源性為100%。
本發(fā)明提供了萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315菌株具有PGPR活性，可產(chǎn)生PGPR物質(zhì)如吲哚こ酸、嗜鐵素、水楊酸、2、3_ ニ羥基苯甲酸、胞外多糖、氰化氫和氨等。上述所述的應(yīng)用是將疋adhaerens CGMCC 6315接種至黃豆(67ァmax L.)上，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽。在含有50-154mmol/L的氯化鈉溶液的脅迫條件下，接種了萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315菌株的黃豆比未接種菌株的對(duì)照組具有更高的發(fā)芽率。


圖I E. adhaerens CGMCC 6315的掃 描電鏡照片。圖2 萬(wàn).aofeaereas CGMCC 6315 的 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖3萬(wàn).aofeaereas CGMCC 6315在固氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落圖。圖4從萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315基因組中克隆nifH基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5疋adhaerens CGMCC 6315的nifH基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)例ー植物根際土壤固氮菌株的分離篩選、鑒定和生物學(xué)特性 I.菌株分離
從江蘇省南京市地區(qū)采集土壌，取2g 土壤加入含10顆玻璃珠的18mL無(wú)菌水中，振蕩5min，靜置IOmin后，取IOml懸液加入250ml含1%葡萄糖的礦物鹽培養(yǎng)基中。礦物鹽培養(yǎng)基的組成為I. 36 g/L KH2PO4, 2. 13g/L Na2HPO4,0. 5 g/L MgSO4 7H20 和 lOmL/L 金屬離子液，pH 7.5。金屬離子液組成為0.40 g/L CaCl2 2H20, 0. 30 g/L H3BO3, 0. 04 g/L CuSO4 5H20, 0. 10 g/L KI, 0. 20 g/L FeSO4 7H20，0. 40 g/L MnSO4 7H20，0. 20 g/LNaMoO4 *2H20和10. 0 mL/L濃鹽酸。樣品于30°C、轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床中培養(yǎng)I個(gè)月。取IOml懸液接種到上述新鮮的含1%葡萄糖的礦物鹽培養(yǎng)基中，并在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)I個(gè)月，重復(fù)上述步驟一次。取100耵樣品稀釋到10_2-10_4后，涂布于LB固體培養(yǎng)基上。LB培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L ;酵母膏5g/L ；NaCl 10g/L ；pH7. 2。從LB平板挑取形態(tài)不同的單菌落劃線至LB平板上，30°C培養(yǎng)1-2天后，再次進(jìn)行菌種平板劃線純化。獲得3株形態(tài)不同的細(xì)菌。固氮菌的篩選
將上述3種細(xì)菌接種到LB平板上，待其長(zhǎng)出單菌落后，挑單菌落劃線到Nfb固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)。Nfb 培養(yǎng)基組成為KH2PO4 1.2 g/L、K2PO4 0.8 g/L、Glucose 5 g/L、MgSO4- 7H20 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaCl. 2H20 0. 02 g/L、FeSO4 7H20 0.002 g/L、金屬離子液 2mL。金屬離子液組成為NaMo04 2H20 1.0 g/L、MnSO4 H2O I. 75 g/L、H3BO3 I. 4 g/L、CuSO4-5H20 0. 04 g/L、ZnSO4 7H20 0. 12 g/L。培養(yǎng)一周后，其中命名為 TMX-23 的菌株在固氮培養(yǎng)基上出現(xiàn)非常明顯的菌落生長(zhǎng)。菌株的鑒定及生物學(xué)特性
在LB固體培養(yǎng)基上，TMX-23菌落呈乳白色、不透明、光滑、有粘液、凸起、邊緣規(guī)整。革蘭氏陰性。如圖I所示，TMX-23菌體呈桿狀，大小為0.4-0.6X1.0-1.5iim。無(wú)鞭毛，無(wú)芽胞。采用16S rDNA序列分析進(jìn)行TMX-23菌株的分子鑒定。從含LB固體培養(yǎng)基上用無(wú)菌牙簽挑取適量的TMX-23菌體到20iU無(wú)菌水的離心管中，混勻，100°C加熱處理lOmin，瞬時(shí)離心，待菌體冷卻，每50 ill PCR體系加入5 作為模板。采用細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增通用正向引物Kl和K2進(jìn)行16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，引物Kl的序列為5’- AACTGAAGAGTTTGATCC TGGCTC-3，(SEQ ID No : I )，引物 K2 的序列為5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQ ID No :2)。PCR 擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性 2min 后，94°C變性lmin，59°C退火I. 5min，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0所得序列由生エ生物工程(上海)有限公司測(cè)序后，得到的部分16S rDNA序列(SEQ ID No :3)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast搜索并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖2所示，TMX-23菌株與及 adhaerens處于同一個(gè)分支，相似性達(dá)到99%。因而TMX-23菌株被鑒定為萬(wàn).adhaerens。TMX-23菌株于年2012年7月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院研究所；保藏編號(hào)為CGMCC No. 6315,分類(lèi)命名為粘著箭菌如パ/ぽadhaerens。固氮酶還原酶基因克隆
E. adhaerens CGMCC 6315在固氮培養(yǎng)基上出現(xiàn)非常明顯的菌落生長(zhǎng)(圖3)，因而進(jìn)ー步克隆其固氮酶還原酶基因進(jìn)行驗(yàn)證。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)提取ムadhaerens CGMCC 6315基因組DNA。采用巢式PCR克隆nifH基因。使用兩對(duì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，弓I物序列分別為N-F-A (5，-GCNWTNTAYGGNAARGGNGG-3，)(W表示堿基為A/T，Y表示堿基為C/T，N表示堿基為A/T/C/G或其它，R表示堿基為A/G, V 表示堿基為 A/C/G，B 表示堿基為 C/G/T) (SEQ ID No :4)、N-F-B (5，-GGNTGTGAYCCNAAVGCNGA-3，)(SEQ ID No 5)和 N-R (5，-GCRTANABNGCCATCATYTC-3，)(SEQ IDNo :6)。以基因組DNA為模板，以引物N-F-A和N-R為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25W)為10 X PCR 緩沖液 2. 5W，dNTP 2^1, MgCl2 2W，引物 N-F-A 0. m,引物 N-R0. 5W，模板(基因組)ll^l，Ex-taq DNA聚合酶0. 5耵，加水至25耵。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min，95°C變性50 S，55°C退火50 s，72°C延伸Imin，反應(yīng)29個(gè)循環(huán)，最后72°C保溫IOmin0用DNA純化試劑盒對(duì)將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。以上述PCR純化產(chǎn)物為模板，以N-F-B和N-R為引物進(jìn)行第二輪PCR。反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同第一輪PCR。第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。對(duì)PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行切膠回收和純化。純化產(chǎn)物采用pMD18-T載體試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行TA克隆后，送生エ生物工程(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示圖4中的條帶I和2為非特異性擴(kuò)增，條帶3 (SEQ ID No 7)和條帶4 (SEQ ID No 8)測(cè)得的序列均為368bp。在genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast分析顯示,條帶3和條帶4均為nifH基因，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖5)顯示條帶3測(cè)得的DNA序列與如Wffer sp. TJ170的nifH基因同源性為100% ;條帶4測(cè)得的序列與藍(lán)細(xì)菌むsp. MCC-3A的nifH基因的同源性為100%。上述結(jié)果表明萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315有兩種不同的固氮酶還原酶基因。實(shí)例ニ^: adhaerens CGMCC 6315 菌株的 PGPR 活性測(cè)定
參照Bric等1991年報(bào)道的方法測(cè)定口引哚こ酸IAA的含量；參照Alexander和Zubererl991年報(bào)道的方法在鉻天青固體平板上測(cè)定鐵載體siderophore的分泌；參照Reeves等1983年報(bào)道的方法測(cè)定水楊酸SA和2，3_ ニ羥基苯甲酸DHBA的含量；胞外多糖EPS含量測(cè)定參照Mody等1989年報(bào)道的方法；磷的釋放、氰化氫和氨的釋放按照Schippers等1990年報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果表明萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315菌株培養(yǎng)24h后產(chǎn)生8. 2Mg/mL卩引哚こ酸、5. 7 mg/mL胞外多糖、培養(yǎng)48h后產(chǎn)生6. 9 Mg/mL水楊酸和0. 48 Mg/mL2, 3-ニ輕基苯甲酸;萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315分泌嗜鐵素,氰化氫和氨，但不具有溶磷作用。上述結(jié)果表明萬(wàn).adhaerens CGMCC 6315是ー種植物根際促生細(xì)菌。實(shí)例三在鹽脅迫條件下，在黃豆表面接種疋adhaerens CGMCC 6315可促進(jìn)其發(fā)芽
挑取大小一致的黃豆若干顆，自來(lái)水浸泡6 h。用70%こ醇消毒30S，用無(wú)菌水沖洗去除こ醇。瓦adhaerens CGMCC 6315菌體在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，離心、無(wú)菌水洗滌后，用不同濃度的氯化鈉溶液懸浮，菌體濃度調(diào)節(jié)為IO8菌落形成単位(CFU)。將經(jīng)上述處理過(guò)的黃豆分別放入含有菌株的不同濃度的NaCl溶液中浸泡30min。在9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿底放入ー層滅菌濾紙，加 入4mL上述不同濃度的NaCl溶液。每個(gè)培養(yǎng)皿放入20顆上述經(jīng)處理的黃豆，培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行，重復(fù)三次。4d后計(jì)算發(fā)芽率。在50mmol/L的NaCl濃度下，接種了萬(wàn).adhaerens CGMCC6315的黃豆的發(fā)芽率由對(duì)照組的58. 9%提高到67. 2%。實(shí)例四與實(shí)例三相同，NaCl濃度提高至100mmol/L。接種了萬(wàn).adhaerens CGMCC6315的黃豆的發(fā)芽率由對(duì)照組的52. 8%提高到63. 9%。實(shí)例五與實(shí)例三相同,在154mmol/L NaCl濃度下,接種了允adhaerens CGMCC6315的黃豆的發(fā)芽率由未接種菌株的42. 8%提高到55. 6%。本發(fā)明并不僅僅限于上述的實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種粘著箭菌StZAaerefl1S),它的保藏編號(hào)為CGMCC 6315。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述粘著箭菌adhaerens)CGMCC6315,其特征在于,該菌株為固氮菌，其基因組上具有如SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示的固氮酶還原酶基因片段序列。
3.粘著箭菌(Aasi/eradhaerens) CGMCC 6315在提高黃豆發(fā)芽率中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法,其特征在于,是將粘著箭菌adhaerens)CGMCC 6315接種至黃豆上，在含有50mmol/L至154mmol/L濃度的氯化鈉的鹽溶液中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)芽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了粘著箭菌Ensiferadhaerens CGMCC 6315是一種具有固氮能力的細(xì)菌；該菌株也是一種植物根際促生細(xì)菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)，可產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)、胞外多糖(EPS)、嗜鐵素(siderophore)、水楊酸(SA)、2，3-二羥基苯甲酸(DHBA)、氰化氫(HCN)和氨。在含有氯化鈉的鹽脅迫條件下，接種了E.adhaerens CGMCC 6315的黃豆可比未接種菌株的對(duì)照組具有更高的發(fā)芽率。
文檔編號(hào)A23L1/202GK102851237SQ201210277930
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者戴亦軍, 王穎, 翟閃, 周廣燦, 葛峰, 袁生 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)