專利名稱：一種改進的叢枝菌根孢子密度快速測定方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物菌根真菌學中孢子密度測定方法，具體涉及一種叢枝菌根真菌孢子密度快速測定方法。
背景技術：
叢枝菌根真菌是自然界中普遍存在的一種土壤微生物(簡稱AM)。陸地90％以上的有花植物都能夠與它形成菌根共生體，菌根對煤礦區生態修復具有明顯的生態效應。叢枝菌根真菌由菌根孢子(果)、叢枝體、泡囊、菌絲組成，都可以作為繁殖體。孢子不僅是作為叢枝菌根真菌營養儲存的器官，也是一種穩定的繁殖體，它的形態特征目前仍是叢枝菌根真菌分類學的重要依據。選用叢枝菌根真菌孢子作為接種源，不僅可以得到單一的菌根，而且也可以通過菌根真菌孢子的萌發來了解菌根真菌對外界條件的適應程度。因此，適生的菌根真菌孢子的篩選和分離對于研究菌根真菌孢子在土壤中的分布、存在數量和種類以及研究菌根在煤礦區生態恢復的適應性具有重要的意義。目前孢子收集的方法主要有濕篩傾析法、柱析法、漂浮法和離心法，但是常用的方法仍是濕篩傾析法和離心法。這些方法的共同點都是能夠將菌根孢子從生長基質中富積起來，但是孢子與基質的小顆粒特別是沙粒顏色相近，不易于辨別。因此，菌根在礦區生態重建、土壤修復以及農業生物肥力等方面越來越廣的應用情況下，很難達到大批量樣品的菌根孢子密度快速測定。

發明內容
針對現有技術中的上述不足，本發明將提供一種能快速測定大批量樣品菌根孢子密度的方法，即對孢子密度常規測定方法濕篩傾析法作了改進，本技術為快速測定大批量樣品孢子密度提供科學方法。
完成上述發明任務的方案是一種改進的叢枝菌根孢子密度快速測定方法，包括以下步驟(1)稱取一定重量的土壤標本，放在容器內用水浸泡20-30分鐘，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常規的土壤分散劑；(2)選用一套潔凈的、具有孔徑為0.5-0.034微米的土壤篩，按孔徑由大至小的順序從上到下依次疊放，最底層用一固體物墊著，使篩面稍微傾斜；(3)用玻璃棒攪動浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物沉淀下去，然后將懸浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一層的土壤篩上，傾倒時，集中倒在篩面的一個點上，避免整個篩面都沾有土壤溶液；(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，以免在上層粗篩面的剩留物中殘留有叢枝菌根真菌孢子，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個清潔的培養皿里面；
(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個干凈的試管內，滴加曲利本藍染色劑，放在90℃水浴鍋或烘箱中加熱半小時，進行染色；(6)將染色后的濾液通過細篩，并沖洗篩上的濾物，洗去染色劑，將篩出物放在干凈的培養皿里，在沖洗下來的篩出物中，除許多細的沙礫和雜質外，其余為不同直徑的叢枝菌根真菌的孢子；(7)將篩出物放在雙目實體解剖顯微鏡下觀察，可觀測到紫色孢子。
本發明充分挖掘了菌根真菌中繁殖體孢子(果)、菌絲用曲利本藍染色能夠染成紫色的特點，經過染色后的菌絲、菌根孢子的形態特性與篩出物的色彩差異明顯，在顯微鏡觀測下易于識別和辨認，可以顯著地提高孢子密度測定的精度和速度。
常規的濕篩傾析法，在雙目實體解剖顯微鏡下觀察到菌根孢子和菌絲色澤與周圍的沙粒基質相近，為棕黃色，不易于辨別和測定，而利用染色法觀察到的孢子和菌絲呈紫色，與周圍沙粒色澤反差較大，孢子從形態特性上觀測更加明顯，對叢枝菌根孢子的識別則是一目了然，染色法較常規的濕篩傾析法更易于識別和辨認菌根孢子。以傳統的濕篩傾析法來統計待測樣品的孢子密度，10克沙土樣品孢子數平均為350個，而利用染色法來測定相同樣品的孢子數平均為380個，每個土壤樣品精度提高了8％，提高了孢子密度測定的精度。
利用常規的濕篩傾析法測定孢子密度，本試驗條件下需要45-50分鐘時間來計數完成一個沙土樣品(10克土350個孢子)。而利用染色法則需要花費25-30分鐘時間來計數完成1個樣品(10克土380個孢子)，測定速度上1個樣品縮短了一半時間(25-30分鐘)，而對本試驗野外40個土樣，在測定速度上節約1000-1200分鐘，即20小時。40個樣品在染色過程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進行染色30分鐘，耗時少，染色后能夠極大地提高孢子密度測定的速度。
利用該染色法，能夠觀測到明顯的菌絲和孢子形態，易于識別、辨認和觀察，能夠極大地提高孢子密度測定的精度和速度，對菌根在礦區生態重建、土壤修復以及農業生物肥力等野外大規模應用后的菌根孢子密度的動態監測提供了一種快速的科學測定方法，尤其對于初學菌根技術的人更是一種可行的快速測定方法。
具體實施方案實施例1(菌劑培養基質)培養基質采自北京市北沙灘地建筑沙土，在裝盆前經高溫高壓蒸汽滅菌(121℃，2h)，自然風干，以供盆栽試驗用。
供試菌種真菌菌種摩西球囊菌(G.mosseae)、地表球囊菌(G.versiforme)和(G.etunicatum)分別由北京市農林科學院植物營養與資源研究所微生物室提供。
供試作物玉米、高粱由中國農業科學院中農種子公司提供。播種前種子用10％H2O2浸泡10分鐘，去離子水反復清洗數遍瀝干備用。
試驗用盆試驗用盆采用20cm×20cm×15cm(高×盆口直徑×盆底直徑)規格的白色塑料盆。盆缽用自來水清洗瀝干后，75％酒精消毒，每盆裝風干基質2.5kg。
試驗方案本研究設計4個處理菌根處理，即接種G.mosseae(處理1)、接種G.versiforme(處理2)、接種G.mosseae和G.versiforme混合菌劑(處理3)、接種G.mosseae、G.versiforme和G.etunicatum的混合菌劑(處理4)，2種供試植物，總共8個處理。其中處理1和處理2是4個重復，處理3、處理4是10個重復，總共56盆。
試驗在7月5日播種，1個月后每盆定苗至2株，定時定量施加Hoagland營養液，維持基質持水量在60％-80％之間，3個月后收獲。基質風干后用濕篩傾析法和濕篩傾析染色法測定叢枝菌根真菌孢子數。
以傳統的濕篩傾析法來統計孢子密度，10克沙土樣品孢子數平均為350個，需要45-50分鐘時間計數完成一個樣品(10克土350個孢子)；而利用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數平均為380個，需要花費25-30分鐘時間計數完成1個樣品(10克土380個孢子)，從精度上每個土壤樣品平均提高了8％，從測定速度上1個樣品縮短了一半時間(25-30分鐘)，一共有76個樣品，總共可以省1900～2280分鐘，即節省33～38個小時，用濕篩傾析染色法測定孢子密度極大的提高了孢子密度測定的精度和速度，該方法適于大批量樣品的孢子密度測定。
實施例2(菌劑在寧夏煤矸石山生態重建中的野外應用)試驗用地寧夏大武口洗煤廠煤矸石山，該地位于寧夏回族自治區石嘴山市，屬于中溫帶干旱氣候區，降水稀少而集中，光照充足，蒸發強烈，空氣干燥，極不利于煤矸石山植被恢復。本試驗地點選擇煤矸石山上，煤矸石山上鋪了0.8-1m厚的河沙作為生長基質。該沙土pH為8.12，電導率EC為6.67μS/cm，最大持水量為14.48％，有效磷2.9ppm，有效氮5.27ppm，有效鉀97ppm，屬于極貧瘠的沙土。
試驗材料供試菌種為本實驗室增殖培養的Glomus mosseae和Glomus etunicatum混合菌劑(簡稱G.spp)。供試植物是當地先鋒植株白蠟幼苗，裸根栽植，株高1米左右。
試驗設計和管理試驗在2005年4月18日種植，設接種和不接種兩處理，接種192株，不接種204株，總共396株。每株穴播接種50g混合菌根菌劑。白蠟株距為1米，在接種和不接種之間有隔離帶，間距為2米，地邊周圍有田埂，總共約500m2。栽植后主要是水分管理，首次澆水采用大水漫灌澆透，每周澆水2次，1個月后每周澆水1次，2個月后2周澆水1次，每次澆水都灌透，3個月后植株免水分管理自然生長。
3、6和13個月后測定采集樣品的孢子密度，每次采集接菌、不接菌各10個樣品，三次采樣總共60樣品，采用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數，從測定速度上1個樣品縮短了一半時間(25-30分鐘)，一共有60個樣品，總共可以省1500～1800分鐘，即節省25～30個小時，60個樣品在染色過程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進行染色30分鐘，用濕篩傾析染色法測定孢子密度極大地提高了孢子密度測定速度。
試驗例3(菌劑在內蒙神東生態恢復地野外應用)與實施例2基本相同，但試驗選擇地為神華集團神東煤炭分公司大柳塔西山北區生態常綠林區供試土壤pH8，供試植物為新疆楊樹。供試菌種為本實驗室增殖培養的Glomus mosseae和Glomus etunicatum混合菌劑(簡稱G.spp)，植株常規養護。
3和6個月后測定采集樣品的孢子密度，每次采集接菌、不接菌各10個樣品，三次采樣總共60樣品，采用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數，從測定速度上1個樣品縮短了一半時間(25-30分鐘)，一共有60個樣品，總共可以省1500～1800分鐘，即節省25～30個小時，60個樣品在染色過程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進行染色30分鐘，用濕篩傾析染色法測定孢子密度極大地提高了孢子密度測定速度。
權利要求
1.一種叢枝菌根真菌孢子密度快速測定方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取一定重量的土壤標本，放在容器內用水浸泡20-30分鐘，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常規的土壤分散劑；(2)選用一套潔凈的、具有孔徑為0.5-0.034微米的土壤篩，按孔徑由大至小的順序從上到下依次疊放，最底層用一固體物墊著，使篩面稍微傾斜；(3)用玻璃棒攪動浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物沉淀下去，然后將懸浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一層的土壤篩上，傾倒時，集中倒在篩面的一個點上，避免整個篩面都沾有土壤溶液；(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，以免在上層粗篩面的剩留物中殘留有叢枝菌根真菌孢子，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個清潔的培養皿里面；(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個干凈的試管內，滴加曲利本藍染色劑，放在90℃水浴鍋或烘箱中加熱半小時，進行染色；(6)將染色后的濾液通過細篩，并沖洗篩上的濾物，洗去染色劑，將篩出物放在干凈的培養皿里，在沖洗下來的篩出物中，除許多細的沙礫和雜質外，其余為不同直徑的叢枝菌根真菌的孢子；(7)將篩出物放在雙目實體解剖顯微鏡下觀察，可觀測到紫色孢子。
2.按照權利1要求所述的叢枝菌根真菌孢子密度快速測定方法，其特征在于，比常規的濕篩傾析法增加了染色這一步驟。
3.按照權利2要求所述的叢枝菌根真菌孢子密度快速測定方法，其特征在于，染色后孢子呈紫色，易于辨別形態特性。
全文摘要
菌根生物技術是目前應用于煤礦區生態治理的一種新方法，菌根孢子密度是衡量菌根生態適應性的標準之一。孢子密度的測定采用的優化方法是濕篩傾析染色法。優化方案中采用曲利本藍對基質中的孢子、菌絲進行染色，發現經染色后基質中的孢子及其菌絲呈紫色，在雙目顯微鏡下觀測孢子的數量和形態更容易識別，計數的精度和速度明顯提高，降低了孢子密度測定過程中的人為誤差。使用本發明的方法對孢子密度常規測定方法--濕篩傾析法作了改進發明，以提高了試驗測定的精度和速度，為檢驗菌根技術在野外大規模的生態應用效果提供了一種孢子密度快速測定方法。
文檔編號C12Q1/02GK1979127SQ20061016532
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月18日 優先權日2006年12月18日
發明者畢銀麗, 吳王燕, 全文智 申請人:中國礦業大學(北京)