專利名稱：多環芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術領域，特別涉及一種多環芳烴好氧降解 純菌種的分離純化方法與應用。
背景技術：
多環芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環連在一起構成的烴類化合物，是一類具有致 癌、致畸、致突變作用的有機物，在環境中分布廣泛且具有生物難降解性因而引起人們的廣 泛關注。由于PAHs分子中存在共軛大n鍵電子體系，因此具有較高的穩定性，通常情況下 很難被微生物降解。為了提高PAHs的生物降解速率，馴化篩選出高效降解菌群是非常重要 的一個方面。PAHs的好氧生物降解比厭氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土 壤的異位修復及水污染治理中常用好氧生物處理技術。然而由于很難分離到高效的多環芳烴 降解純菌種，對多環芳烴的降解機理與過程研究不夠深入，從而制約了多環芳烴污染土壤生 物修復技術的進一步發展和應用。因此，因此尋找一種能有效分離純化多環芳烴降解菌的方 法與技術非常有必要，對于治理和修復多環芳烴污染土壤有重要的意義。
由于PAHs是疏水性有機物，大多數多環芳烴化合物難溶于水，其可溶性隨苯環數量的 增多而減少。多環芳經特別是高于四環的稠環芳烴，水溶解性很低且對微生物有較高的毒性 作用，這使得傳統微生物菌種的分離純化方法無法適用于多環芳烴降解純菌種的分離純化。 同時，分離純化的環境條件及過程參數選定等都與能否分離純化成功有密切的關系，這些條 件與參數都需要經過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發明內容
本發明的目的提供一種多環芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應用。其具體步驟如
下
(1) 向體積為500 mL的錐形瓶內加入400 mL基礎培養基、1.0 mL微量金屬液、0.1 mL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養基備用；其中基礎培養基的組成為NH4C1: 1.5 g七—1， KH2P04: 1.5 g.L"， MgCl2: 0.25 g'L"， CaCl2'2H20: 0.10 g'L"; 微量金屬液的組成為 CoCl2.6H20: 50 mgL1， CuCl2: 0.30 mg'L1, H3B03: 10.0 mg.!/1, MnCl24H2。 40 mgl/1， Na2Mo04.2H20: 5.0 mg.L墨1， NiCl2. 2H20: 2.5 mgL", ZnCl2: 3.5 mg!/1。
(2) 向體積為150mL的錐形瓶內加入50mL按步驟(1)配制的液體培養基和0.60 g瓊脂， 然后在溫度為12rC的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 7(TC時，在超凈工作臺中將 其倒入體積為160 mL的培養皿中，為除去培養基表面多余的水分將該培養皿在超凈工作臺中放置2天。
(3) 在超凈工作臺中向步驟(2)中的培養皿中加入0.5mL濃度為l g/L的多環芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉動培養皿使多環芳烴的丙酮溶液均勻分布，為除去培養基表面的丙酮將該培養皿在超凈工作臺中放置2天。
(4) 向體積為25mL的錐形瓶內加入10mL按步驟(1)配制的液體培養基和0.25 g瓊脂，在溫度為12rC的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺中冷卻至38 40'C。
(5) 在超凈工作臺中向步驟(4)的錐形瓶中加入l mL通過富集與馴化篩選得到的多環芳烴好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取l mL慢慢加入步驟(3)中的培養皿中，來回傾斜轉動培養皿使接種有混合菌群的培養基溶液均勻分布。將培養皿放入溫度為25t:的培養箱中培養觀察，10 15天后便可發現有明顯的菌落出現。
(6) 在超凈工作臺中向體積為25 mL的錐形瓶中加入4.0 mL濃度為1 g/L的多環芳烴丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。
(7) 按水與高分子樹脂吸附劑的質量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質量比為3:1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在超凈工作臺中放置2天。
(8) 向步驟(6)中的錐形瓶內加入10mL按步驟(1)配制的液體培養基，然后加入經步驟(7)處理后的吸附劑0.15g,將其密封后放置在轉速為100r/min的振蕩器中平衡2天。
(9) 在超凈工作臺中挑取步驟(5)培養皿中的菌落，將其接種至步驟(8)中的錐形瓶中，在溫度為25 3(TC、轉速為100r/min的振蕩器中培養5 7天。
(10) 將步驟(2)至步驟(9)作為一個分離純化周期；重復步驟(2)至步驟(9),但每次用前一個分離純化周期中步驟(9)的菌液代替步驟(5)中用到的多環芳烴好氧降解菌群溶液。分離純化8個周期以上即可得到能夠高效好氧降解多環芳烴的純菌種。
所述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
本發明的有益效果是所述的方法能夠分離純化到對多環芳烴好氧降解性能好的微生物純菌種。
具體實施例方式
在超凈工作臺中制作以多環芳烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養基底層平板，在底層平板上制作含有多環芳烴好氧降解菌群的瓊脂固體培養基頂層平板，將制作好的培養基平板在培養箱中培養10 15天。在超凈工作臺中向加入多環芳烴、基礎培養基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內接入培養基平板中的菌落，在溫度為25 3(TC、轉速為IOO r/min的振蕩器中培養5 7天。然后進行循環轉接，在循環次數大于8次后即可得到能夠好氧降解多環芳烴的純菌種。下面是運用分離純化得到的菌種進行了多環芳烴的好氧降解試驗，以進一步說明本發明。實施例1
運用本發明方法分離純化的菌種在好氧條件下進行了萘的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對萘進行有效的好氧降解，當萘的初始濃度為26.1 mg/L時，2天后能降解到0.02mg/L以下。
實施例2
運用本發明方法分離純化的菌種在好氧條件下進行了菲的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對菲進行有效的好氧降解，當菲的初始濃度為1.05mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下。
實施例3
運用本發明方法分離純化的菌種在好氧條件下進行了芴的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對芴進行有效的好氧降解，當芴的初始濃度為0.11mg/L時，l天后能降解到0.01mg/L以下。
實施例4
運用本發明方法分離純化的菌種在好氧條件下進行了芘的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對芘進行有效的好氧降解，當芘的初始濃度為0.10mg/L時，l天后能降解到0.01mg/L以下。
權利要求
1.一種多環芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)向體積為500mL的錐形瓶內加入400mL基礎培養基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養基備用；其中基礎培養基的組成為NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O50mg·L-1，CuCl20.30mg·L-1，H3BO310.0mg·L-1，MnCl2·4H2O40mg·L-1，Na2MoO4·2H2O5.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.5mg·L-1，ZnCl23.5mg·L-1 id="icf0001" file="A2008101471120002C1.tif" wi="1" he="5" top= "70" left = "149" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(2)向體積為150mL的錐形瓶內加入50mL按步驟(1)配制的液體培養基和0.60g瓊脂，然后在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65～70℃時，在超凈工作臺中將其倒入體積為160mL的培養皿中，為除去培養基表面多余的水分將該培養皿在超凈工作臺中放置2天 id="icf0002" file="A2008101471120002C2.tif" wi="3" he="3" top= "103" left = "33" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(3)在超凈工作臺中向步驟(2)中的培養皿中加入0.5mL濃度為1g/L的多環芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉動培養皿使多環芳烴的丙酮溶液均勻分布，為除去培養基表面的丙酮將該培養皿在超凈工作臺中放置2天 id="icf0003" file="A2008101471120002C3.tif" wi="2" he="3" top= "127" left = "76" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(4)向體積為25mL的錐形瓶內加入10mL按步驟(1)配制的液體培養基和0.25g瓊脂，在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺中冷卻至38～40℃ id="icf0004" file="A2008101471120002C4.tif" wi="2" he="4" top= "144" left = "151" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(5)在超凈工作臺中向步驟(4)的錐形瓶中加入1mL通過富集與馴化篩選得到的多環芳烴好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取1mL慢慢加入步驟(3)中的培養皿中，來回傾斜轉動培養皿使接種有混合菌群的培養基溶液均勻分布。將培養皿放入溫度為25℃的培養箱中培養觀察，10～15天后便可發現有明顯的菌落出現 id="icf0005" file="A2008101471120002C5.tif" wi="3" he="5" top= "177" left = "98" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(6)在超凈工作臺中向體積為25mL的錐形瓶中加入4.0mL濃度為1g/L的多環芳烴丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天 id="icf0006" file="A2008101471120002C6.tif" wi="5" he="3" top= "193" left = "104" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(7)按水與高分子樹脂吸附劑的質量比為5∶1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質量比為3∶1的比例用99％的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在超凈工作臺中放置2天 id="icf0007" file="A2008101471120002C7.tif" wi="4" he="3" top= "218" left = "121" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(8)向步驟(6)中的錐形瓶內加入10mL按步驟(1)配制的液體培養基，然后加入經步驟(7)處理后的吸附劑0.15g，將其密封后放置在轉速為100r/min的振蕩器中平衡2天 id="icf0008" file="A2008101471120002C8.tif" wi="2" he="3" top= "235" left = "187" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(9)在超凈工作臺中挑取步驟(5)培養皿中的菌落，將其接種至步驟(8)中的錐形瓶中，在溫度為25～30℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養5～7天 id="icf0009" file="A2008101471120002C9.tif" wi="4" he="3" top= "251" left = "134" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(10)將步驟(2)至步驟(9)作為一個分離純化周期；重復步驟(2)至步驟(9)，但每次用前一個分離純化周期中步驟(9)的菌液代替步驟(5)中用到的多環芳烴好氧降解菌群溶液。分離純化8個周期以上即可得到能夠高效好氧降解多環芳烴的純菌種。
2. 根據權利要求1所述多環芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，所述吸 附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
3. —種權利要求l所述多環芳經厭氧降解純菌種的應用，運用本發明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進行了萘的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對萘進行有效的好氧 降解，當萘的初始濃度為26.1mg/L時，2天后能降解到0.02mg/L以下。
4. 一種權利要求l所述多環芳烴厭氧降解純菌種的應用，運用本發明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進行了菲的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對菲進行有效的好氧 降解，當菲的初始濃度為1.05mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下。
5. —種權利要求l所述多環芳烴厭氧降解純菌種的應用，運用本發明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進行了芴的好氧降解試驗，結果表明分離出的純菌種能夠對芴進行有效的好氧 降解，當芴的初始濃度為0.11mg/L時，l天后能降解到0.01mg/L以下。
6. 運用本發明方法分離純化的菌種在好氧條件下進行了芘的好氧降解試驗，結果表明分 離出的純菌種能夠對芘進行有效的好氧降解，當芘的初始濃度為0.10mg/L時，l天后能降解 到0.01mg/L以下。
全文摘要
本發明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術領域的一種多環芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應用。超凈工作臺中制作以多環芳烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養基底層平板，在底層平板上制作含有多環芳烴好氧降解菌群的瓊脂固體培養基頂層平板，將制作好的培養基平板在培養箱中培養10～15天。在在超凈工作臺中向加入多環芳烴、基礎培養基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內接入培養基平板中的菌落，在溫度為25～30℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養5～7天。然后進行循環轉接，在循環次數大于8次后即可得到能夠好氧降解多環芳烴的純菌種。本方法能夠分離純化得到對多環芳烴好氧降解性能好的微生物純菌種。
文檔編號C12N1/00GK101654656SQ20081014711
公開日2010年2月24日 申請日期2008年8月19日 優先權日2008年8月19日
發明者丁愛中, 豆俊峰 申請人:北京師范大學