專利名稱：多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術領域，特別涉及一種多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。
背景技術：
多環芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環連在一起構成的烴類化合物，是一類具有致癌、致畸、致突變作用的有機物，在環境中分布廣泛且具有生物難降解性因而引起人們的廣泛關注。由于PAHs分子中存在共軛大n鍵電子體系，因此具有較高的穩定性，通常情況下很難被微生物降解。為了提高PAHs的生物降解速率，馴化篩選出高效降解菌群是非常重要的一個方面。PAHs的好氧生物降解比厭氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土壤的異位修復及水污染治理中常用好氧生物處理技術。然而由于缺少高效的多環芳烴降解菌，制約了多環芳烴污染土壤生物修復技術的進一步發展和應用。因此，需要從污染的環境中馴化篩選出降解速率較快的土著微生物菌群，然后再把它們應用于實際PAHs污染環境的生物治理，這對于治理和修復多環芳烴污染土壤有重要的意義。
由于PAHs是疏水性有機物，大多數多環芳烴化合物難溶于水，其可溶性隨苯環數量的增多而減少。多環芳烴特別是高于四環的稠環芳烴，水溶解性很低且對微生物有較高的毒性作用，這使得常規馴化與篩選微生物菌群的技術無法適用于對降解多環芳烴微生物群的馴化與篩選。而且馴化的環境條件，馴化周期，及馴化的過程參數選定等都對馴化出菌群的降解效能有密切的關系，這些都需要經過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發明內容
本發明的目的提供一種多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。其具體步驟如下-
(1) 選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網篩后立即放置于4'C冰箱中保存備用。
(2) 向體積為1000mL的開口玻璃瓶中加入25 30mL濃度為1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200:10:1:1，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。
(3) 向步驟(2)中開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎培養基，在轉速為100r/min的條件下攪拌40 50min后加入步驟(1)中的土壤250g;然后置于溫度為25~30°C的環境中在轉速為100r/min的條件下攪拌富集馴化培養30d，在培養期間定期向玻璃瓶中加入基礎培養基以維持玻璃瓶中泥漿系統的水土比例保持不變；其中基礎培養基的組成為NH4Cl:1.5g丄"，KH2P04: 1.5g.L"， MgCl2: 0.25 gl/'， CaClr2H20: 0.10 gl/'。
(4) 向體積為100 200mL的錐形瓶中加入10mL濃度為1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200:10:1:1，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。
(5) 按水與高分子樹脂吸附劑的質量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質量比為3:1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60'C的烘箱中放置2天。
(6) 向步驟(4)中的錐形瓶中入50mL基礎培養基、0.5mL微量金屬液和0.1 mL維生素c溶液；其中微量金屬液的組成為CoCh^HzOJSmg'L-1, CuCl2: 0.20 mg.1/1， H3B03: 6.0mg.1/1， MnCl24H20:25mg.L"， Na2Mo04'2H20: 3.0 mg-L" ， NiClr 2H20: 2.0 mgl/1， ZnCl2:2.5mg.1/1。
(7) 向步驟(6)中的錐形瓶內加入步驟(5)處理后的吸附劑0.35g，將其密封后放置在轉速為100r/min的振蕩器中平衡2天。
(8) 向步驟(7)中的錐形瓶內接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為25~30°C轉速為100r/min的振蕩器中培養5 7天，每天打開瓶口一次以恢復錐形瓶內的溶解氧；按接種體積比為200 250:1的比例轉入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內，當轉接次數大于8之后即可獲得高效去除多環芳烴的好氧降解菌群。
所述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
本發明的有益效果是所述的方法能夠富集與馴化篩選到對多環芳烴具有好氧降解性能好的微生物菌群，對萘、菲、笏和芘的好氧降解速率分別為5.46mg丄+d"; 0.48mg丄"，d";0.05 mg.L".d"及0.06 mgL"cT1。
具體實施例方式
本發明提供一種多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。向加入多環芳烴和基礎培養基的開口玻璃瓶內加入受石油污染的土壤進行多環芳烴好氧降解微生物的富集與馴化，30d后向加入多環芳烴、基礎培養基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內接入富集馴化的土壤。在溫度為25 3(TC、轉速為100r/min的振蕩器中培養5 7天后，進行循環轉接，在循環次數大于8次后即可得到高效去除多環芳烴的好氧降解菌群。
下面是以運用馴化的菌群進行了多環芳烴的好氧降解試驗，進一步說明本發明。
實施例 '
運用本發明方法馴化的菌群進行了多環芳烴的好氧降解試驗，結果表明菌群能夠對萘、菲、藥和芘進行有效的好氧降解；當萘的初始濃度為27.4mg/L時，5天后能降解到0.01mg/L以下，當菲的初始濃度為1.01mg/L時，2天后能降解到0.05mg/L以下，當笏的初始濃度為O.llmg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下，當芘的初始濃度為0.12 mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分別為(菌體濃度為5xlO"個/mL) : 5.46mg.L".d"; 0.48mgL"d"; 0.05 mgL"d"及0.06 mgL十d.1。
權利要求
1.一種多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網篩后立即放置于4℃冰箱中保存備用。(2)向體積為1000mL的開口玻璃瓶中加入25～30mL濃度為1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200∶10∶1∶1，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。(3)向步驟(2)中開口玻璃瓶中加入500～600mL基礎培養基，在轉速為100r/min的條件下攪拌40～50min后加入步驟(1)中的土壤250g；然后置于溫度為25～30℃的環境中在轉速為100r/min的條件下攪拌富集馴化培養30d，在培養期間定期向玻璃瓶中加入基礎培養基以維持玻璃瓶中泥漿系統的水土比例保持不變；其中基礎培養基的組成為NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1。(4)向體積為100～200mL的錐形瓶中加入10mL濃度為1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200∶10∶1∶1，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。(5)按水與高分子樹脂吸附劑的質量比為5∶1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質量比為3∶1的比例用99％的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60℃的烘箱中放置2天。(6)向步驟(4)中的錐形瓶中入50mL基礎培養基、0.5mL微量金屬液和0.1mL維生素c溶液；其中微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O35mg·L-1，CuCl20.20mg·L-1，H3BO36.0mg·L-1，MnCl2·4H2O25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.0mg·L-1，ZnCl22.5mg·L-1。(7)向步驟(6)中的錐形瓶內加入步驟(5)處理后的吸附劑0.35g，將其密封后放置在轉速為100r/min的振蕩器中平衡2天。(8)向步驟(7)中的錐形瓶內接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為25～30℃轉速為100r/min的振蕩器中培養5～7天，每天打開瓶口一次以恢復錐形瓶內的溶解氧；按接種體積比為200～250∶1的比例轉入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內，當轉接次數大于8之后即可獲得高效去除多環芳烴的好氧降解菌群。
2. 根據權利要求1所述多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選技術，其特征在于，所 述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
3. —種權利要求1所述多環芳烴好氧降解菌群的應用，其特征在于，運用馴化的菌群進行 ,了多環芳烴的好氧降解試驗，結果表明菌群能夠對萘、菲、芴和芘進行有效的好氧降解；當 萘的初始濃度為27.4mg/L時，5天后能降解到0.01mg/L以下，當菲的初始濃度為l.Ol mg/L時，2天后能降解到0.05mg/L以下，當芴的初始濃度為O.ll mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下， 當芘的初始濃度為0.12mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、笏和芘的好氧降解速 率分別為(菌體濃度為5xl()7個/mL) : 5.46mgL"d"; 0.48 mgL"d"; 0.05 mg'L"d"及0.06 mg,L"-cT1。
全文摘要
本發明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術領域的一種多環芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。向加入多環芳烴和基礎培養基的開口玻璃瓶內加入受石油污染的土壤進行多環芳烴好氧降解微生物的富集與馴化，30d后向加入多環芳烴、基礎培養基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內接入富集馴化的土壤。在溫度為25～30℃、轉速為100r/min的振蕩器中培養5～7天后，進行循環轉接，在循環次數大于8次后即可得到高效去除多環芳烴的好氧降解菌群。本方法能夠富集與馴化篩選到對多環芳烴具有好氧降解性能好的微生物菌群，對萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分別為5.46mg·L^-1·d^-1；0.48mg·L^-1·d^-1；0.05mg·L^-1·d^-1及0.06mg·L^-1·d^-1。
文檔編號C12N1/00GK101654657SQ20081014711
公開日2010年2月24日 申請日期2008年8月19日 優先權日2008年8月19日
發明者丁愛中, 豆俊峰 申請人:北京師范大學