專利名稱：：一種新型的基因突變重組方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，涉及一種基因的體外分子進化的方法以及該方法在蛋白質(酶)編碼基因的隨機突變文庫構建中的應用。
背景技術：
：基因突變技術是分子生物學研究中的常用策略，廣泛應用于各種基因功能的改造和研究方面。基因突變技，不僅可以獲得基因中特定序列與基因功能之間關系的信息，而且還可以通過對編碼蛋白質(尤其是各種酶)的基因的突變對相應的蛋白質進行改造，通過這種策略可以研究蛋白質的功能或者對獲得具有新的催化特性的突變蛋白質(酶)。在蛋白質工程領域中，常常需要對某種天然的酶進行改造從而獲得各方面酶學性質得到提高的突變酶。蛋白質工程中的基因突變通常包括定點突變和隨機突變兩種策略，其中，定點突變的針對性強但需要對蛋白質結構與功能的信息有所了解，對于缺乏結構與勁能的信息的蛋白質，這種策略往往不能湊效。基因突變另一種策略是蛋白質(酶)的體外定向進化(i"vi的directedevolution),它不需事先了解酶的結構和催化機制，而是通過模擬自然進化機制，人為地對編碼蛋白質的基因進行隨機突變，在獲得大量突變體的基礎上應用高通量的篩選策略定向篩選所需要的突變蛋白質(酶:)。酶的定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究領域和應用范圍，不僅可以應用于天然酶的改造以獲得催化性能更優異的突變酶，同時也為研究蛋白質(酶)的結構與功能提供了新的途徑。在過去的十多年中，定向進化技術已被廣泛用于改善蛋白質(酶)的多種性質如酶的穩定性與催化活性、底物特異性、酶的新功能、新型疫苗和藥物分子的發現、抗體親和力的提高等諸多方面。定向進化技術不僅在實驗室用于科學研究，而且己有定向進化的酶制劑進入市場，顯示了蛋白質定向進化技術在蛋白質工程中的巨大應用前景。目前已經發展出一些方法與技術用于蛋白質的定向進化，并成功地應用于許多蛋白質(酶)的改造。定向進化的第一步，需要應用一定的方法構建一個隨機突變庫。目前主要的方法包括易錯聚合酶鏈式反應(PCR)，由于其簡便快速而成為其中最常用的方法，但通常只能引入單一核苷酸的突變。為了克服易錯PCR的這個缺陷，DNA改組(DNAshu他ng)技術應運而生，其核心就是利用DNaseI隨機切割一組高度同源的核苷酸序列，使之片段化，再通過PCR延伸，最后組裝成一個完整的編碼序列。在這個過程中就可以把不同DNA分子間的突變或差異重組形成一個新的突變基因。DNAshuffling已經成為目前定向進化研究的主要技術方法，已經成功地應用于多種蛋白質的改造，并取得了良好的效果。DNAshuffling技利用易錯PCR獲得突變序列；再利用DNaseI將這些片段隨機切割成小片段，通過無引物的PCR將小片段進行重新延伸組裝獲得一個突變基因庫，DNAshuffling技術在引入突變多樣性上十分高效，但在DNAshuffling中DNaseI隨機切割操作過程不容易控制，費時費力，必須設立平行實驗。這也是它的不足所在。在DNAshuffling的基礎上，又發展出一系列改進技術，如家族改組(familyshuffling),利用單鏈DNA(ssDNAs)為模板的DNAshuffling等。除了DNAshuffling夕卜，近年來發展起來的隨機引物體外重組法(random-priminginvitrorecombination,RPR)、交錯延伸(staggeredextensionprocess)等方法也應用于蛋白質(酶)的改造上，但應用的并不廣泛，文獻報道較少。
發明內容本發明針對常規DNAshuffling方法的不足，提供了一種基于內切核酸酶(endoV)的新型的基因隨機突變的方法并將其應用于脫毛蛋白酶隨機突變文庫的構建。本發明中提供的基因隨機突變文庫構建的基本原理如附圖l所示，其原理基于一種內切核酸酶(endoV)，endoV參與修復含有脫氨基的異常堿基，它能夠特異在dITP的3'端臨近的核苷酸水解磷酸二酯鍵，導致DNA斷裂。在本發明中，在目標基因片段擴增的PCR反應體系中加入dITP，在PCR反應中由于dITP能夠與4種正常的核苷酸配對，體系中的dITP就得以隨機摻入PCR的擴增產物中，經過多次PCR循環，最終獲得期望的PCR產物，而且在擴增的目標基因片段由于引入了dITP，同時也引入相應的隨機點突變。將獲得的突變目標基因利用特異識別dITP的核酸酶endoV進行酶切，將其片段化，將獲得的突變目標基因小片段經過PCR延伸和組裝，最后獲得重新組裝的目標基因的突變基因庫，應用合適的篩選方法可以從突變基因庫中篩選新的突變體蛋白質(酶)。本發明中首先提供了一個基因突變重組的新方法。本方法以一個在大腸桿菌中容易表達檢測的報告基因(如卡拉霉素抗性基因，faM)作為耙基因，利用包含dITP的PCR反應體系，通過對PCR體系中dITP的摻入比例，PCR反應條件的優化PCR反應中DNA聚合酶的來源的選擇，擴增出包含隨機多點突變的靶序列。然后利用endoV對dIMP特異設別和切割的特點，將目標序列片段化獲得相互重疊的小片段DNA，最后利用常規PCR，將小片段DNA延伸組裝產生一個突變重組基因庫。在基因突變重組的方法中，突變產生于第一輪的PCR和第二輪的重新組裝，為了獲得期望的突變分布和頻率，對這兩歩反應后的產物進行分析評價是必要的，在建立基因突變新方法的基礎上，本發明同時提供了一個操作性強、重復性好評價這種基因突變新方法的分析評價流程首先在優化試驗步驟中，在每歩結朿后，取定量的DNA產物，按常規分子生物學4技術，克隆測序，對得到的序列進行分析統計從而分析突變的分布和頻率；其次，將兩步突變的報告基因(to")克隆轉化大腸桿菌，誘導表達，通過檢測表達產物來評價突變效率和分布，最終分析突變效率和分布于蛋白活性的關系。在本發明中同時提供了將基因突變重組方法在實際蛋白質(酶)基因隨機突變文庫構建中的一個應用實例。應用本發明建立的方法，構建脫毛蛋白酶隨機突變文庫，并利用平板初步篩選的方法從隨機突變文庫中篩選到蛋白酶酶活提高的突變蛋白酶，對這些篩選得到的突變酶進行序列測定了催化性質鑒定，結果證實本發明提供的基因突變重組方法可以有效構建蛋白質(酶)突變文庫，是一種高效的蛋白質體外進化技術，在蛋白質工程領域具有巨大的應用前景。圖l基于dITP和endoV酶的基因隨機突變技術的原理圖。圖2以卡那霉素抗性基因(Aa")作為目標基因的基因隨機突變技術的建立。(A)不同'dNTP/dlTP比例條件通過PCR將dlTP隨機摻入到目標序列中，以此產生隨機突變；(B)特異識別dITP的核酸酶(endoV)對突變目標基因的酶切；(C)，將(B)中獲得的突變基因小片段進行無引物PCR,對片段進行組裝；(D)，利用PCR對由(C)獲得的重新組裝的突變基因進行重新放大。圖3以脫毛蛋白酶基因隨機突變技術的建立。(A):不同dNTP/dlTP比例條件通過PCR將dITP隨機摻入到目標序列中，擴增脫毛蛋白酶基因以產生隨機突變；(B):特異識別dITP的核酸酶(endoV)對突變脫毛蛋白酶基因的酶切；(C):將(B)中獲得的突變基因小片段進行無引物PCR，對片段進行組裝；(D):利用PCR對由(C)獲得的重新組裝的突變基因進行重新放大。圖4對脫毛蛋白酶基因隨機突變文庫的平板篩選的部分結果，(箭頭指示對照克隆)。具體實施方式實施例l:目標基因的擴增本方法擬選擇卡那霉素抗性基因a朋)作為目標基因進行易錯PCR，事先來自于質粒載體pCMABIA1302中的fam基因表達單元，通過PCR擴增，然后插入pUC18載體，獲得皿一個包含有few和氨芐青霉素(。wp)抗性的重組質粒pl8Kan，然后以pl8Kan載體作為DNA模板，以人工合成的一對引物(見后)進行了^w基因片段的擴增，并進行了條件的優化，其結果如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR引物分別為上游引物；5'-CCTGTGATCACCGCGGTTTC-3'，下劃線為限制酶5adl切割位點。下'ii引物；5'-CTGTTCTTCCCCGATATCCTCC-3'，下劃線為限制酶￡coRV切割位點。該對引物擴增出預期PCR產物大小為0.89bp，該片段包括&"抗性基因的5'端編碼區及非編碼區，但3'端不完整。該片段可以用SflcII和JE:coRV酶切，并克隆插入pl8Kan質粒相應位點，通過在大腸桿菌中fem抗性的選擇，即可獲得突變的h"基因新片段。PCR反應條件的參數設置為:95。C預變性2min;94。C變性lmin，58。C復性1min，72。C延伸1min，共30個循環；最后72。C再延伸10min。PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實施例2:目標基因的易錯PCR根據實施例l，以卡那霉素抗性基因(fom)作為目標基因進行易錯PCR。本方法不同于常規的易錯PCR方法，而是將核苷酸類似物(dITP)通過PCR技術隨機摻入到產物序列中，以此形成隨機點突變。為了控制在PCR反應過程中摻入目標序列中dITP的頻率和數目，以便在隨后的酶切步驟能夠獲得大小適宜的目標基因的小片段，首先需要對PCR反應體系中的dNTP和dITP的比例進行優化。需要具體步驟為在100^1的PCR體系中，如下表所示將體系中dNTP:dITP比例分別調整為8:0,6:2,5:3，4:4，3:5,2:6。dNTP(2.5mM)8/d8/d一3/d2/ddlTP(2.5mM)5^1dNTP:dITP8:06:25:34:43:5,2:6PCR反應條件的參數同實施例1所述。最后的PCR產物通過1免的瓊脂糖凝膠電泳檢領J，結果如附圖2A所示，在各種dNTP:dITP比例的條件下均可獲得預期大小的目標基因擴增產物。實施例3:突變基因的隨機片段化'利用endoV對獲得的突變基因進行酶切，酶切的反應體系為20^1，其中PCR產物IO閃，endoV緩沖液2^1，內切核酸酶endoV(MBI公司)1U，65°C條件下酶切60分鐘，經95。C條件下加熱15分鐘終止酶切反應，產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如附圖2B所示隨著dNTP:dITP比例的減小，endoV酶切后產生的片段越小，也說明摻入的dITP的位點增加。當dNTP:dITP為2:6時，酶切后DNA片段分別主要集中在150bp以下；當dNTP:dITP為3:5時，酶切片段主要分布在200-50bp。這個范圍一般都認為適合用于DNA組裝。實施例4:突變基因小片段的無引物重組裝將實施例3獲得的突變基因的小片段進行無引物PCR，以對小片段序列進行延伸和重組裝。無引物PCR反應體系如下表所示PCR反應條件的參數設置為95°C預變性2min;94°C變性1min，50°C復性30s，72°C延伸30s，每增加一個循環增加延伸時間2s，共45個循環；最后72°C延伸10min。PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。試劑(濃度)體積(al)終濃度10xPCRbuffer10lxMg2'(25mM)61.5mM突變基因小片段1dNTP(2.5mM)8200岸DNA聚合酶(5U/yl)15U加ddH20補齊至ij100pi7結果如附圖2C所示，各種dNTP:dITP比例的酶切小片段經過組裝后均獲得了呈彌散狀的組裝產物，其大小分布從0.05kb到大于lkb范圍。實施例5:重組裝基因的重新放大將實施例4獲得的重組裝基因片段作為模版，采用常規的PCR反應，將點突變和重組裝的/^/z片段重新放大，PCR參數同實施例1所述。重新放大結果(附圖2D)顯示，dNTP:dITP比例為5:3，6:2時的重組裝產物經過放大擴增后，能獲得預期大小的目標基因。將獲得的經過重新放大的DNA片段，經過&cII和EcoRV酶切后，與相應的載體連接、轉化大腸桿菌，分別以fa^和a/^抗性作篩選，均可獲得這些突變片段。結果顯示大多數克隆失去h"抗性，少數克隆仍然保留了foz"抗性。最后，隨機挑選&"抗性克隆進行DNA序列測定，結果表明，這些DNA序列均出現了多少不一的突變。實施例5:本發明在蛋白酶基因突變文庫構建中的應用例證為了驗證本發明中提供的基因突變重組技術在實際蛋白質(酶)基因隨機突變文庫構建中的適用性，利用本發明提供的方法，以脫毛堿性蛋白酶脫毛基因為目標基因，通過PCR摻入dITP片段化組裝和重新發放大獲得了隨機突變的脫毛蛋白酶基因；最后經過酶切、克隆；構建了一個符合預期的堿性蛋白酶基因突變文庫(附圖3)。并對該文庫進行了初步篩選，并對篩選得到的部分突變脫毛蛋白酶進行了序列測定和酶活測定，結果表明篩選得到的突變酶的活性較野生型有不同程度的提高(附圖4)。通過該例證證明本發明所描述的方法確實可以用于基因的隨機突變和改組。權利要求1、一種新的基因突變重組方法，包括目標序列的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，酶切片段化，基于PCR的序列延伸和組裝，其特征是(a)將一種核苷酸類似物2-脫氧次黃嘌呤核苷-5-三磷酸(dITP)加入擴增目標基因片段的PCR反應體系中，在PCR反應的延伸步驟中，體系中的dITP能夠摻入到擴增的目標基因序列中，從而獲得包含dITP的多點隨機突變的目標基因；(b)利用特異識別dITP的內切核酸酶endoV酶切步驟(a)獲得的突變基因序列使之片段化；(c)將獲得的片段化的隨機突變基因片段經過無引物的PCR延伸和組裝，最后獲得具有重新組裝的突變基因庫，以備篩選新的突變體蛋白質；(d)利用目標基因序列特異性引物，對從步驟(C)獲得的重新組裝的突變基因進行常規的PCR擴增，從而對突變文庫進行重新放大，提高文庫中隨機突變基因的數目。2、權利l所述的方法在各種蛋白質(酶)編碼基因的隨機突變文庫構建中的應用。全文摘要本發明屬于基因工程領域，涉及到一種基因突變重組的方法以及在蛋白質(酶)基因突變文庫建立中的應用。在擴增目標序列的聚合酶鏈式反應(PCR)體系中，通過PCR反應將核苷酸類似物2-脫氧次黃嘌呤核苷-5-三磷酸(dITP)隨機摻入到靶基因序列中從而產生多點隨機突變，利用特異識別切割dITP的內切核酸酶V(endoV)將擴增的目標基因序列片段化，然后利用無引物PCR將獲得的突變目標基因小片段進行延伸和重組裝，最后獲得重新組裝的目標基因的突變基因庫。本發明提供的方法克服了傳統DNA改組(DNAshuffling)方法利用核酸內切酶I(DNaseI)隨機切割目標序列過程中不易控制，費時費力等不足，可廣泛應用于各種蛋白質(酶)編碼基因的隨機突變文庫的構建。文檔編號C12P19/00GK101532043SQ200910059019公開日2009年9月16日申請日期2009年4月22日優先權日2009年4月22日發明者萬民遠,紅馮,張義正,念李,楊慶軍申請人:四川大學