Afp和gm-csf雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明所述的雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)甲胎蛋白以及粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對(duì)肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
【專利說明】AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年發(fā)生的肝癌占全世界的50%以上，肝癌死亡率己占全國(guó)腫瘤死亡率的第二位，是一種嚴(yán)重威脅人們生命健康的疾病。手術(shù)切除是目前療效最好的肝癌治療手段，目前肝移植技術(shù)亦相當(dāng)成熟，但由于費(fèi)用高、供體來源困難，術(shù)后使用抗排斥藥物會(huì)因免疫抑制而使殘癌生長(zhǎng)更快和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等問題，對(duì)中晚期肝癌的療效欠佳。
[0003]近年來，隨著分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，腫瘤免疫治療已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，多種免疫治療方法已用于肝癌的臨床研究，比如細(xì)胞因子治療、自體完整的腫瘤細(xì)胞疫苗、效應(yīng)細(xì)胞回輸治療、以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的肝癌疫苗等。研究學(xué)者認(rèn)為，肝癌特別適宜于免疫治療，原因如下:(I)肝癌化療效果不明顯，常規(guī)不應(yīng)進(jìn)行化療，因而免疫系統(tǒng)不會(huì)因?yàn)榛煻軗p；(2)肝癌腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)較慢，有足夠時(shí)間用以開展和加強(qiáng)有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)；(3)肝臟足多血供器官，免疫效應(yīng)細(xì)胞容易浸潤(rùn)并增殖；(4)肝癌病灶多局限于肝內(nèi)，臨床隨訪時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)的影像學(xué)技術(shù)比較容易對(duì)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行定量評(píng)估，有利于治療效果的判斷。其中，細(xì)胞因子基因免疫治療是腫瘤免疫治療與基因治療的結(jié)合，其通過將具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，并使之穩(wěn)定有效地表達(dá)，使體內(nèi)持續(xù)存在一定水平的內(nèi)源性細(xì)胞因子，以發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而，目前的細(xì)胞因子基因免疫治療方法缺乏腫瘤靶向性，其抗腫瘤效果有待提高。
[0004]粒細(xì)胞一巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage ColonyStimulating Factor,GM-CSF)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子,它不僅可誘導(dǎo)在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的DC細(xì)胞成熟、分化，而且在免疫治療過程中可增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，以促進(jìn)DC等APC分化、成熟和活化以及上調(diào)協(xié)同刺激分子(如CD86)的表達(dá)水平，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和ADCC效應(yīng)等活性，促進(jìn)Th、Tc、NK細(xì)胞在腫瘤部位浸潤(rùn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。GM-CSF目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫治療，GM-CSF以其顯著的免疫調(diào)節(jié)作用和低毒性，成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的免疫治療研究中均取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機(jī)體的GM-CSF蛋白表達(dá)水平，其免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0005]甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein, AFP)是一個(gè)胚胎特異性的α-球蛋白，是哺乳動(dòng)物早期胚胎血清中的一個(gè)重要的組份。正常情況下，AFP是由胎兒的肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的，胎兒出生后，血清中的AFP含量迅速下降，在正常的成人體內(nèi)是檢測(cè)不到或僅有極其微量的AFP。AFP是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，一直以來被認(rèn)為是診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的重要標(biāo)志物。在成人中，約有80%的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的血清中，都可以檢測(cè)到AFP的表達(dá)，顯示AFP篩查是發(fā)現(xiàn)早期肝癌的一種高效的手段。AFP可以作為腫瘤標(biāo)志物，作為腫瘤免疫治療的靶位，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，腫瘤細(xì)胞可以在其表面表達(dá)并遞呈AFP多肽與MHC復(fù)合物，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。研究表明，AFP可以和多種抗癌藥物結(jié)合，并通過受體介導(dǎo)的胞吞作用選擇性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而靶向、高效地殺死腫瘤細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對(duì)肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供所述AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供所述AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在肝癌的基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0009]AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0010]在其中一個(gè) 實(shí)施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
[0011]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
[0012]本發(fā)明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0013]I)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段；
[0014]2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構(gòu)建含有AFP基因的重組載體；
[0015]3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段；
[0016]4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體。
[0017]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0018]a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段:從肝癌細(xì)胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的AFP特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有BglII和EcoR I酶切位點(diǎn)的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0019]b)構(gòu)建pIRES2-AFP-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Bgl I1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體；
[0020]c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0021]d)構(gòu)建pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c)得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-AFP-GM-CSF 重組載體。
[0022]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)所述的AFP特異性引物為:
[0023]AFP 上游引物:5 ’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3，，
[0024]AFP 下游引物:5 ’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3 ’。
[0025]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)引物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成:
[0026]GM-CSF第一引物對(duì)為:
[0027]GM-CSF 上游長(zhǎng)弓丨物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0028]GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ；
[0029]GM-CSF第二引物對(duì)為: [0030]GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0031]GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
[0032]本發(fā)明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在肝癌基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0033]在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行肝癌基因免疫治療。
[0034]本發(fā)明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)甲胎蛋白(AFP)以及粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源基因序列的引入。其中，AFP是腫瘤靶向性的相關(guān)抗原，GM-CSF是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，兩者聯(lián)合使用，既可以發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又可以靶向性地針對(duì)特定腫瘤產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，從而能夠獲得更好的肝癌免疫治療效果。將雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，AFP的大量表達(dá)，可刺激樹突狀細(xì)胞遞呈AFP多肽與MHC復(fù)合物，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細(xì)胞，靶向性地殺傷表達(dá)AFP多肽的腫瘤細(xì)胞；而GM-CSF的大量表達(dá)，能進(jìn)一步增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，還能誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟、分化，促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，一方面增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，另一方面作為免疫佐劑，協(xié)同擴(kuò)大抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[0035]IRES序列是來源于某些病毒和細(xì)胞mRNA5’端的一段非翻譯區(qū)，可以不依賴帽的方式啟動(dòng)遠(yuǎn)端的mRNA翻譯，可在上游啟動(dòng)子的控制下和與之相連的基因共同轉(zhuǎn)錄，在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，多個(gè)基因的mRNA在同一條轉(zhuǎn)錄子上，但轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程相互獨(dú)立，上游基因以傳統(tǒng)方式進(jìn)行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進(jìn)行翻譯，保證了各個(gè)基因的獨(dú)立結(jié)構(gòu)及功能。利用IRES代替內(nèi)部啟動(dòng)子，不但可使多基因共表達(dá)載體大大縮小，而且還克服了傳統(tǒng)多基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子之間的相互抑制現(xiàn)象，避免融合蛋白的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為實(shí)施例一所得的含有特異性酶切位點(diǎn)序列的AFP基因片段的電泳圖，其中，I為AFP基因，M為標(biāo)記；
[0037]圖2 為 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒圖譜；
[0038]圖3為實(shí)施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體圖譜；
[0039]圖4為實(shí)施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0040]圖5為實(shí)施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0041]圖6為實(shí)施例三所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的GM-CSF基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B，M為標(biāo)記；
[0042]圖7為實(shí)施例三所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0043]圖8為實(shí)施例四所得的PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體圖譜；
[0044]圖9為實(shí)施例四所得的PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為Bgl II/EcoR I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為Bgl I I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施例中，所用到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，例如PCR技術(shù)、引物設(shè)計(jì)技術(shù)、載體構(gòu)建技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、電泳技術(shù)等均為基因工程中的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社第三版；或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行)。在操作過程中所用到的設(shè)備、試劑、載體、菌株等，均為通過市場(chǎng)購(gòu)買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0046]實(shí)施例一:獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段
[0047]1、引物設(shè)計(jì)
[0048]根據(jù)AFP基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)以及pIRES2_EGFP質(zhì)粒載體上預(yù)期插入的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物如下:
[0049]AFP上游引物(如序列表中SEQ ID N0:4所示):
[0050]5? -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3?(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點(diǎn)序列)，
[0051]AFP下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0052]5，-TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)序列)。
[0053]2、獲取cDNA模板
[0054]TRIzon法從人肝癌細(xì)胞H印G2中提取RNA(TRIzon總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為CW0580)，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為RR019A)。
[0055]3、獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段[0056]以人肝癌細(xì)胞H印G2中提取的RNA所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，通過PCR反應(yīng)獲得AFP基因片段，其上游含有Bgl II酶切位點(diǎn)序列，下游含有EcoR I酶切位點(diǎn)序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0057]PCR反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0058]
eDNA 模R (IOOngZpL)LOpL,
AFP 1:游引物(ΙΟμΜ)2.0pL,
AFP 下游引物(IΟμΜ)2.0μΙ,
2 X Prime STAR Max DNA Polymerase 25pL,
滅爾蒸餾水20μΙο
[0059]其中，2XPrime STAR Max DNA Polymerase為DNA聚合酶-緩沖液復(fù)合物，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為R045A。
[0060]PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;98°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸5s，30個(gè)循環(huán)；72°C最終延伸5min。
[0061]實(shí)施例二:pIRES2-AFP_EGFP重組載體的構(gòu)建
[0062]使用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I，分別酶切pIRES2_EGFP質(zhì)粒(該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處含有Bgl II, EcoR I酶切位點(diǎn))以及實(shí)施例一所得的AFP基因片段，得到酶切后線性化的PIRES2-EGFP載體以及酶切后的AFP基因序列；采用T4DNA連接酶體系進(jìn)行連接反應(yīng)，在22°C下孵育30分鐘，然后在70°C下滅活5分鐘，構(gòu)建pIRES2_AFP_EGFP重組載體(如圖3所示)。
[0063]由pIRES2-EGFP質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(如圖2所示)可知，AFP基因插入pIRES2_EGFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，位于質(zhì)粒載體的自身序列IRES的上游(如圖3所示)，即在同一啟動(dòng)子啟動(dòng)下的AFP和EGFP序列分別表達(dá)。
[0064]1、雙酶切 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒
[0065]酶切反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0066]
pIRES2-EGFP 質(zhì)粒(IOOng^iL) 20μΙ,
Λ 切 _ Bgl 丨 I (I Ου/μ? )2 ,OpL,
內(nèi)切ft EcoR I (15υ/μ?)2.0μ?,
10ΧΗ Buffer (丨馨切緩沖液)5.0pL?
無#?蒸鎦水21μ?ο
[0067]其中，內(nèi)切酶Bgl II與10ΧΗ Buffer為Bgl II內(nèi)切酶緩沖液體系，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為1021A ;內(nèi)切酶EcoR I與IOXH Buffer為EcoR I內(nèi)切酶緩沖液體系，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為1040A。
[0068]酶切反應(yīng)條件:在37°C下反應(yīng)6個(gè)小時(shí)。[0069]2、雙酶切AFP基因片段
[0070]酶切反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0071]
【權(quán)利要求】
1.AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因； 所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述的載體為pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2_AFP-GM_CSF重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
4.權(quán)利要求1所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: 1)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段； 2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構(gòu)建含有AFP基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段； 4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體。
5.權(quán)利要求2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟:` a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的AFP基因片段:從肝癌細(xì)胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的AFP特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構(gòu)建pIRES2-AFP-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶BglI1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構(gòu)建pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstXI, Not I酶切步驟b )得到的PIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c )得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-AFP-GM-CSF 重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的AFP特異性引物為: AFP 上游引物:5’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3’， AFP 下游引物:5’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)弓丨物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成: GM-CSF第一引物對(duì)為: GM-CSF 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’ -GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ； GM-CSF第二引物對(duì)為: GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
8.權(quán)利要求1或2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在肝癌基因免疫治療中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行肝癌基因免疫治療。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103555762SQ201310571899
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】栗炳南, 豐慧根, 左百樂, 林俊堂, 曹毓林 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院