專利名稱：Hsv1-tk基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組溶瘤腺病毒，特別涉及HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，還涉 及該重組溶瘤腺病毒的制備方法和應用。
背景技術：
腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，腫瘤治療新方法的研究一直是醫學和生命科學 研究的重點。腫瘤的生物治療已被世界醫學界公認為是繼手術、放射治療和化學治療之后 的第四大治療方法，其中免疫治療與基因治療更是生物治療中最有效、最前沿的科研項目。
腫瘤基因治療的原理是將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞，使其表達此基因 而獲得特定的功能，繼而執行或介導對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達到治療之目的。基因 治療主要涉及目的基因、載體及受體細胞三方面。載體影響目的基因導入和表達的效率，是 決定腫瘤基因治療成敗的關鍵因素。載體可分為病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又 可分為復制型病毒載體和復制缺陷型病毒載體。為了確保在體治療的安全性，傳統的病毒 載體采用復制缺陷型病毒載體，但其在技術上很難達到100%的轉染效率。近年來，隨著現 代生物學和醫學技術的發展，復制型病毒載體在腫瘤基因治療中備受矚目。
溶瘤病毒是一種通過遺傳學改變而具有復制能力的病毒，不僅能夠利用腫瘤細胞 中抑癌基因的失活或缺陷，選擇性地在腫瘤細胞內復制，最終導致腫瘤細胞的溶解和死亡， 而且能夠通過死亡的腫瘤細胞釋放出病毒顆粒，產生級聯效應，放大溶細胞效果，直至腫瘤 細胞被全部清除。此外，腫瘤細胞的破裂會釋放出腫瘤抗原，從而誘導機體抗腫瘤免疫反 應，這也可能增強病毒的溶細胞效果。利用這種病毒進行的腫瘤治療稱為溶瘤病毒治療。既 往研究證實，溶瘤病毒能夠在強力殺死癌細胞的同時確保不傷害正常細胞。
在腫瘤基因治療中，自殺基因療法近年來也顯示出較好的應用前景。該法采用藥 物敏感基因(即自殺基因)轉染腫瘤細胞，以提高腫瘤細胞對無毒的前體藥物的敏感性，從 而達到殺傷腫瘤細胞的目的。至今已發現多個自殺基因，其中研究最多的是胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)基因。目前用于基因治療的TK基因為病毒TK基因，包括單純皰疹病毒I型胸苷 激酶(HSV1-TK)基因和水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶(VZW-TK)基因等，尤以前者應用最多。 HSV1-TK基因轉錄部分約1300個核苷酸，蛋白質編碼區為1128個核苷酸，編碼376個密碼 子，基因中無內含子，其轉錄起始部(Mrna5p端)有107個核苷酸的非翻譯區。用于HSV-TK 基因療法的前體藥物包括丙氧鳥苷(GCV)和無環鳥苷(ACV)等，其中GCV對HSV-TK轉基因 瘤細胞的抑制作用比ACV強10倍，為目前HSV-TK基因療法中最常用的前體藥物。GCV和ACV 本身對細胞無毒害作用，TK可以將其磷酸化為二磷酸核苷，后者在細胞內激酶作用下形成 三磷酸核苷，三磷酸核苷具有強烈的細胞毒性，能抑制DNA聚合酶活性或作為DNA鏈延伸的 終止子阻止DNA合成，最終導致細胞死亡。這種獨特的自殺效應能選擇性地殺死腫瘤細胞 而保護正常細胞，從而避免了傳統腫瘤治療方法對人體帶來的傷害。此外，研究還表明，轉 導了自殺基因的腫瘤細胞在給予前體藥物后被殺死，其相鄰或更遠的未被轉染的腫瘤細胞 也可被殺死，這種作用被稱為旁觀者效應。旁觀者效應明顯擴大了自殺基因的細胞殺傷范圍，顯示了其對于腫瘤治療的獨特優勢，并大大克服了自殺基因轉染率的限制。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，有效 結合自殺基因和溶瘤病毒的特性，轉染效率高，穩定性好，腫瘤治療譜廣；目的之二在于提 供所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法；目的之三在于提供所述HSV1-TK基因重 組溶瘤腺病毒的應用。 為達到上述目的，本發明采用如下技術方案 1、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次 包含啟動子、腺病毒E1區基因和HSV1-TK全長編碼基因。
進一步，所述腺病毒El區基因為E1A全長編碼基因；
進一步，所述啟動子為CMV啟動子。 2、所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，包括以下步驟 a、克隆兩端分別帶有Not I酶切位點和Xholl酶切位點的HSV1-TK全長編碼基
因； b、克隆兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的E1A全長編碼基因；
c、將兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的E1A全長編碼基因用Xba I和Sal I雙酶切后，插入經相同限制性內切酶處理的腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV中， 得重組質粒pAdTrack-CMV-ElA ;再將兩端分別帶有Notl酶切位點和Xhol I酶切位點的 HSVl-TK全長編碼基因用Not I和XholI雙酶切后，插入經相同限制性內切酶處理的重組質 粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重組腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;
d、將重組腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質粒pBHGE3共轉 染人胚胎腎293細胞進行細胞內同源重組，待出現明顯細胞病變效應時收集細胞，反復凍 融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤腺病 毒。 進一步，步驟a的具體方法為以HSV1基因組DNA為模板，以5' -tagcggcc-gcat ggcttcgtacccctgccatc-3' 和5' _gcctcgaggttagcctcccccatctc_3' 為上下游弓l物，PCR 擴增HSV1-TK全長編碼基因，PCR循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性60 秒，56t:退火90秒，72t:延伸75秒，共35個循環，最后72。C延伸20分鐘；
進一步，步驟b的具體方法為以含有E1A全長編碼基因的pXCl質粒為模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，為上下游弓l物， PCR擴增E1A全長編碼基因，PCR循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分 鐘，56。C退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環。 3、所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應用。 本發明的有益效果在于本發明的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，有效結合自殺
基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在腫瘤細胞中高效復制，同時HSV1-TK基因的表
達產物將無毒的前體藥物轉變為細胞毒性物質，導致腫瘤細胞"自殺"，而正常組織細胞由
于溶瘤病毒不能復制表達HSV1-TK基因，不能將無毒的前體藥物轉變為細胞毒性物質，從
而避免損傷；該重組溶瘤腺病毒還具有轉染效率高，穩定性好，腫瘤治療譜廣，制備方法簡
4單等優點，可用于制備抗腫瘤藥物，在腫瘤基因治療領域有著良好的開發應用前景。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中 圖1為HSV1-TK全長編碼基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為E1A全長編碼基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3為MTT法測定細胞存活率；
圖4為兩組小鼠腫瘤生長曲線圖；
圖5為兩組小鼠生存率圖。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
—、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備
1、構建HSV1-TK基因重組表達載體 將單純皰疹病毒I (HSV1)用LB液體培養基在溫度為37°C 、振搖速度為250r/min 的條件下培養過夜，用基因組DNA分離純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取基 因組DNA，按照試劑盒說明書操作。 根據Genbank登錄號為AF303108. 1的HSV1-TK基因序列設計并合成如下引物F 1:5' -tagcggccgcatggcttcgtacccctgccatc-3'(下劃線部分為Not I酶切位點，SEQ ID No.l);Rl:5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'(下劃線部分為Xhol I酶切位點，SEQ ID No.2)。 以HSV1基因組DNA為模板，以Fl和Rl為上下游引物，PCR擴增HSV1-TK全長編 碼基因，PCR體系為50iU，循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94t:變性60秒，56t: 退火90秒，72t:延伸75秒，共35個循環，最后72"C延伸20分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠 電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pGEM-T質粒在T4DNA連接酶的作用下連接， 連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提 取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為pGEM-T-TK。 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約1100bp處呈單一特異性條帶(圖1)，與 目的片段大小相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ IDNo.3)與GenBank 登錄號為AF303108. 1的HSV1-TK全長編碼基因序列一致。
2、構建E1A基因重組表達載體 根據Genbank登錄號為NC 001460. 1的E1A基因序列設計并合成如下引物F2 : 5， _gci￡i^g^accatgagacatattatc_3，(下劃線部分為Xba I酶切位點，SEQ IDNo. 4) ;R2 : 5' -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，(下劃線部分為Sal I酶切位點，SEQID No. 5)。
以含有E1A全長編碼基因的pXCl質粒為模板，以F2和R2為上下游引物，PCR擴 增E1A全長編碼基因，PCR體系為50 ii l，循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘，56t:退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒 定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，用限制性內切酶Xbal和Sal I雙酶切，雙酶切產物經 凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經XbaI和Sal I雙酶切的pDC315質粒連接，連接 產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質 粒，Xba I和Sal I雙酶切鑒定和測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為pAdSU。
瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約800bp處呈單一特異性條帶(圖2)，與目 的片段大小相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ IDNo.6)與GenBank登 錄號為NC 001460. 1的EIA全長編碼基因序列一致。
3、構建HSV1-TK基因重組腺病毒穿梭質粒 將pAdSU質粒用Xba I和Sal I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純 化后，與同樣經Xba I和Sal I雙酶切的腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV連接，連接產物轉 化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，Xba I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為pAdTrack-CMV-ElA ;再將pGEM-T-TK質粒用 Not I和Xhol I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經Not I和 Xhol I雙酶切的pAdTrack-CMV-ElA質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，Not I和Xhol I雙酶切鑒定，將陽 性克隆質粒命名為pAdTrack-CMV-ElA-TK。
4、制備HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒 將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至T-25培養瓶中，待 細胞生長至30% 50%融合時棄去培養液，采用脂質體法將重組腺病毒穿梭質粒 pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質粒pBHGE3共轉染293細胞，進行胞內同源重組，通過 顯微鏡觀察細胞病理改變，待出現明顯細胞病變效應時離心收集細胞，用PBS重懸，反復凍 融4次使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤 腺病毒原液；將病毒原液重新感染293細胞以擴增病毒，收集含病毒的上清液，用氯化銫梯 度超速離心法純化，4t:透析過夜，測定病毒滴度，-7(TC保存備用。
二、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用檢測
1、體外抗腫瘤作用 MTT法測定細胞存活率分別將人肝癌細胞H印G2和美洲綠猴腎細胞C0S-7接種 于96孔板，培養24小時后，將HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒按感染復數(M0I)為100感染 細胞，同時設置相應對照組(用PBS替代HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒)，感染4天后，每孔 加入濃度為50mg/ml的MTT (用PBS配制)20 y 1， 37"培養4小時，棄去含MTT的培養液，加 入酸化異丙醇100 y 1，充分溶解后，在酶標儀上測定波長595nm處的吸光度A值，按下述公 式計算細胞存活率細胞存活率=A樣。。。/A柳g X 100%。 結果見圖3，經HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒處理的腫瘤細胞H印G2的存活率明顯 下降，平均存活率為24% ;而經HSVl-TK基因重組溶瘤腺病毒處理的正常細胞C0S-7的存 活率未見明顯變化，平均存活率為78%。
2、體內抗腫瘤作用 將1 X 105個H印G2細胞接種于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，將荷瘤裸鼠隨機分為兩 組對照組和實驗組，對照組尾靜脈注射PBS，實驗組尾靜脈注射HSV1-TK基因重組溶瘤腺
6病毒，觀察60天內兩組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。 結果兩組小鼠腫瘤生長曲線見圖4，第30天時，對照組小鼠腫瘤體積達到
5000mm 而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為2000mm3 ;兩組小鼠生存率見圖5，對照
組小鼠于30天內全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為50% ;說明本發明的HSV1-TK基
因重組溶瘤腺病毒能夠有效抑制腫瘤細胞的生長，同時能夠延長荷瘤裸鼠的平均生存期并
提高平均生存率。 最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參
照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可
以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明
的精神和范圍。 序列表 〈110〉中國人民解放軍第三軍醫大學 〈120>HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應用 〈160>6 〈210>1 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物F1 〈400〉 1 tagcggccgc atggcttcgt acccctgcca tc 32 〈210>2 〈211>26 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物R1 〈400>2 gcctcgaggt tagcctcccc catctc 26
〈210>3
〈211>1131
〈212>DNA 〈213>單純皰疹病毒I (Herpessimplexvirus-1)
〈400>3 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccategca accgacgtec ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctectg cgggtttete tegacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggt tcgcgcgacga tetcgtctec 240
7gtacccgagccgatgacttectggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc300tecacc3C3caacaccgcctcg3cc3gggt g卿tetcgg ccggggEicgc ggcggtggte360atgac朋gcgcccagateacaatgggcatg ccttetgccg tgaccgacgc cgttctggct420cctcatetcggggggg郷ctgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc■ttcgaccgccatcccatcgccgccctcctg tgctecccgg ccgcgcgate ccttetgggc540agcatgaccccccaggccgtgctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc6003C3朋C3tCgtgttgggggcccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc660cagcgccccggcgagcggcttgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttecggg720ctgcttgccaatecggtgcggtetctgC3g ggCggCgggt CgtggCgggEl gg￡lttgggg￡l780cagctttcggggacggccgtgccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca840cgaccccatetcggggacacgttetttecc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc■朋cggcgacctgteteacgtgtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt960cccatgcacgtctttatcctggattecgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg1020ctgcaacttecctccgggatggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cateccgacg1080atctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgg gg3gtggggg郷Ct雄tg 31131〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物F2〈400>4gctctegaacC3tg3g3C3tattetc26〈210>5〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物Rl〈400>5gcgtcgacttatggcctggggcg23〈210>6 [o川]〈211>801 〈212>DNA〈213>腺病毒(adenovirus)〈400>6atgag朋ctg 3朋tgactcccttggtcctg tcgtetcagg aagctgacga catettggag60catttggtgg acaactttttteacgaggte cccagtgatg atgatcttte tgttccgtct120ctttecgaactgtetgatcttgatgtggag tctgccggtg aagateatea tgaacaggcg180
8
gtg皿tgagttttttcccgaatcgcttettttegctgccagtg郷ggttgttttteccg240gagcctcctgtectttctcctgtctgtgagcctettgggggcg皿tgtetgccacaactg300caccctgaagatetggatttattgtgctecg卿tgggctttccctgtegcgattcgg皿360gacgagc皿g3Cg3g皿Cgg皿tggcgcatgtttctgcatccgcagctgctgctgccgct420gateggg皿cgtg郷agtttcagttegaccatccagagttgcccggacac皿ttgteag■tcctgtgagc3CC3CCgg皿tegtectggaaatectgactteatgtgctctttgtgctet540ctgcgagcctacaacatgttcatttecagtcctgtttccgateatgagcctgaaccteat600agcactttgggcgaccctcacccccga皿ctegg皿gtgcggttccag皿660ggagteateaaacctgtgcctcagcgggtg3Ctggg郷Cgt卿tgtgctgtgg腿gc720attttggatttgattc^gagg皿g皿3gatgcctgttgatctgtcagtg780aaacgccctegatgteatte80權利要求
HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次包含啟動子、腺病毒E1區基因和HSV1-TK全長編碼基因。
2. 根據權利要求1所述的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述腺病毒El 區基因為EIA全長編碼基因。
3. 根據權利要求1所述的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述啟動子為 CMV啟動子。
4. 權利要求1所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征在于包括以下 步驟a、 克隆兩端分別帶有Not I酶切位點和Xhol I酶切位點的HSV1-TK全長編碼基因；b、 克隆兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的EIA全長編碼基因；c、 將兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的EIA全長編碼基因用Xba I 和Sal I雙酶切后，插入經相同限制性內切酶處理的腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV中， 得重組質粒pAdTrack-CMV-ElA ;再將兩端分別帶有Notl酶切位點和Xhol I酶切位點的 HSVl-TK全長編碼基因用Not I和Xhol I雙酶切后，插入經相同限制性內切酶處理的重組 質粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重組腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;d、 將重組腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質粒pBHGE3共轉染人 胚胎腎293細胞進行細胞內同源重組，待出現明顯細胞病變效應時收集細胞，反復凍融使 細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒。
5. 根據權利要求4所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征在于步驟 a的具體方法為以HSV1基因組DNA為模板，以5' -tagcggcc-gcatggcttcgtacccctgccatc -3'和5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'為上下游引物，PCR擴增HSV1-TK全長編碼 基因，PCR循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94t:變性60秒，56。C退火90秒，72°C 延伸75秒，共35個循環，最后72t:延伸20分鐘。
6. 根據權利要求4所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟b的具體方法為以含有E1A全長編碼基因的pXCl質粒為模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，為上下游弓l物， PCR擴增E1A全長編碼基因，PCR循環條件參數為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分 鐘，56。C退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環。
7. 權利要求1所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應用，該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次包含啟動子、腺病毒E1區基因和HSV1-TK全長編碼基因；該重組溶瘤腺病毒有效結合自殺基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在腫瘤細胞中高效復制，同時HSV1-TK基因的表達產物將無毒的前體藥物轉變為細胞毒性物質，導致腫瘤細胞“自殺”；該重組溶瘤腺病毒還具有轉染效率高，穩定性好，腫瘤治療譜廣，制備方法簡單等優點，可用于制備抗腫瘤藥物，在腫瘤基因治療領域有著良好的開發應用前景。
文檔編號A61P35/00GK101768576SQ20101004200
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月4日 優先權日2010年1月4日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學