專利名稱：一種快速檢測kras基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測KRAS基因突變的方法。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導(dǎo)致基因型疾病的重要原因之一。基因突變分析在生物醫(yī)學(xué)研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號
傳遞給下游細胞因子后恢復(fù)非激活狀態(tài)；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號活化便始終處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致細胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結(jié)合，阻斷細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達到抑制癌細胞增殖的目的；多項研究發(fā)現(xiàn)，接受抗EGFR藥物治療的結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益具有更高的藥物客觀反應(yīng)率和較長的生存時間。因此，能夠準確檢測KRAS突變狀態(tài)對指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者臨床用藥有重要意義。傳統(tǒng)檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經(jīng)典是雙脫氧測序技術(shù)，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術(shù)。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數(shù)方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數(shù)方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結(jié)果，準確度和靈敏度受到限制。近年來，等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,ARMS)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)等方法改善了檢測的靈敏度和特異性，但仍存在假陽性現(xiàn)象嚴重和操作繁瑣等缺點。分子信標探針(Molecular Beacon)是一種可以自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核昔酸探針，其5’末端標記有突光基團，3’末端標記有洋滅基團；當頸環(huán)結(jié)構(gòu)形成后，突光基團和淬滅基團空間距離靠近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光基團被外界光源激發(fā)后發(fā)出的光子被淬滅基團吸收，此時探針不能被激發(fā)出熒光；若體系中存在與探針序列相匹配的模板，當分子信標探針與模板雜交后，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，使得熒光基團與淬滅基團空間距離增大，此時突光基團被激發(fā)出的突光未被淬滅，可以檢測突光信號；同時由于突光強度與體系中模板的量呈正比，故分子信標探針可以用于實時定量PCR反應(yīng)。當分子信標與模板鏈雜交后，若繼續(xù)升高溫度可導(dǎo)致探針與模板再次分離，從而使得熒光強度隨溫度升高而降低。將熒光強度對溫度變化時間求導(dǎo)數(shù)便得到熔解曲線，熔解曲線的峰值為熒光信號降低速率最大時對應(yīng)的溫度，即為模板與探針結(jié)合強度(Tm值)。由于序列的差別，探針與野生型模板和突變型模板的結(jié)合強度有差別，表現(xiàn)在熔解曲線(熔解峰)的不同。傳統(tǒng)的熔解曲線法靈敏度較低，使得檢測結(jié)果不準確。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點，本發(fā)明提出一種快速檢測KRAS基因突變的方法，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，檢測
結(jié)果更可靠。為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下基本技術(shù)方案。
一種快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(I)分子信標探針和模板擴增引物的設(shè)計及合成上游引物(25nt):5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’延伸阻滯引物(38nt):
權(quán)利要求
1.一種快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟 (1)分子信標探針和模板擴增引物的設(shè)計及合成 上游引物(25nt):·5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’ 延伸阻滯引物(38nt):
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于 以單管反應(yīng)體系25iil計，反應(yīng)管中加入上游引物500nM，延伸阻滯引物50nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U，5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase) 0. 5U，dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)200 u M，dUTP (脫氧尿苷三磷酸)400 u M，分子信標探針 250nM，10 X PCRBuffer (TIANNIUM Taq PCR Buffer) 2. 5 y 1，ddH20補足體積·25 u I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于 PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下:50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，2 5sec ;56°C，(Tlsec ；·65 °C,O^lsec ;55 65個循環(huán)；熔解95°C，l 5min ;50°C— 72 °C每秒收集熒光15 20次，0.02 0. 05 °C梯度升溫。
全文摘要
本發(fā)明提出一種快速檢測KRAS基因突變的方法，以克服傳統(tǒng)探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點。該快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(1)分子信標探針和模板擴增引物的設(shè)計及合成；(2)提取被測樣本的KRAS基因組DNA；(3)配制反應(yīng)體系；(4)PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發(fā)生了KRAS突變。本發(fā)明將分子信標探針和延伸阻滯引物結(jié)合起來，并利用無5’→3’外切酶活性聚合酶進行體外快速檢測KRAS突變，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，使檢測結(jié)果更可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102796817SQ201210233750
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者陳超, 劉金輝, 戴鵬高, 王浩, 王剛 申請人:陜西北美基因股份有限公司