專利名稱：卷煙主流煙氣基因毒性測定方法
技術領域：
本發明涉及巻煙主流煙氣基因毒性評價領域，具體說是一種巻煙主流煙氣基 因毒性測定方法，是通過將細胞暴露于巻煙主流煙氣下，測定主流煙氣引起的細 胞微核增加的比例來進行基因毒性測定。
背景技術：
巻煙煙氣是由幾千種化學物質組成的氣溶膠，其中許多組分對于細胞或人體 都具有一定的毒性作用。科學家們開展了很多關于巻煙煙氣或煙氣中的化學成分
的基因毒性研究，C0RESTA體外毒理學特別工作組推薦選用合適的哺乳動物細胞 用微核實驗方法評價巻煙煙氣的基因毒性。基因毒性測試的目的主要是測試外源 性物質對于DNA的結構或功能潛在的負面作用。目前，基因毒性己經被公認與動 物和人類的癌癥緊密相關。微核實驗是化學物質或混合物的基因毒性測試中應用 最為廣泛的一種。文獻報道暴露于煙氣冷凝物的V79細胞中均可以明顯觀察到微 核的增加[參考文獻l- Channarayapp3, J" Nsth， T Ong. Clsstogenic and ane叩loidogenic
effects of cigarette smoke condensate, Mitomycin C and vincristine sulfate [J]. Mutagenesis, 1992， 7(6) :457-260. 參考文獻2: Veltel D, A Hoheneder. Characterization of cigarette sraoke-induced micronuclei in vitro [J]. Exp. Toxic Pathol, 1996, 48: 548-550. ] o此外在暴露于 煙氣冷凝物的BALB/C-3T3細胞中也可以明顯地發現微核的增加[參考文獻3:M。。re M M， Ho腿a M, Clements J. Mouse lymphoma thymidine kinase locus gene mutation assay: International Workshop on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2000， 35: 185-190.]但以上研究測試的對象為主流煙氣粒相物，將主流煙氣用劍橋濾片進行捕集， 然后將捕集到劍橋濾片的主流煙氣粒相物進行萃取，再進行微核測試。這樣的測 試方法要花費大量的時間，操作繁瑣，且由于測試的只是巻煙主流煙氣粒相物， 沒有測試主流煙氣中的氣相組分，不能反映真實地主流煙氣基因毒性。
發明內容
本發明的目的正是針對上述現有技術僅僅測試捕集到劍橋濾片上的主流煙氣 粒相物對細胞的基因毒性的不足，而專門開發的一種用于巻煙主流煙氣基因毒性 測定方法，本方法還可省略煙氣收集后進行繁瑣的溶劑萃取過程，可以直接并全 面的反映巻煙主流煙氣的基因毒性，該方法操作簡單，靈敏度高，結果可靠。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的先將培養好的細胞直接置入經 過潔凈空氣稀釋的巻煙主流煙氣中進行暴露，暴露過的細胞經培養、離心和冷甲 醇固定，然后用吖啶橙溶液熒光染色，先在低倍鏡(IO倍)下進行觀察，選擇分 布均勻，染色較好的區域，再在熒光顯微鏡下計數，每個樣品計數500個細胞中含 微核(包括單核、雙核和多核)的細胞數量，與潔凈空氣暴露的對照樣品比較， 判斷巻煙主流煙氣引起細胞微核增加的數量，進而判斷巻煙主流煙氣的基因毒性 的大小。
本發明的具體測定方法包括以下步驟
a. 細胞培養將測試細胞接種于細胞培養液中，在C02細胞培養箱中37'C下 培養，當細胞繁殖到一定濃度時計數，并將細胞轉移至T-75mL培養瓶中，濃度為 5 . 0X105-10. 0X105細胞/瓶，添加培養液至總體積20mL，于C02細胞培養箱中37。C 下培養24h;
b. +59組細胞培養每個培養瓶吸出IO ml培養液，用這些培養液配制S9混 合物(53 1111培養液+ 45 ml NADPH(輔酶II)+2 ml S9肝組織勻槳液)，每個培 養瓶加入10ml S9混合物；C.細胞主流煙氣暴露在ISO標準條件下抽吸巻煙，產生的主流煙氣用潔凈 空氣稀釋，煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物(TPM)濃度為指標進行控制， 稀釋后的煙氣直接導入長有細胞的培養瓶(包括-S9組和+S9組兩組樣品，+59表示 加有肝組織勻漿混合物，-S9表示不加肝組織勻槳混合物)中進行主流煙氣暴露。 暴露時間為60min，整個暴露過程根據監測的TPM/L值進行控制，正常對照組(包 括-S9組和+S9組兩組樣品)通入潔凈空氣暴露。
d. 微核測試暴露過的細胞培養2h后，吸出培養液并分別用20ml預熱的D-PBS (含Ca2+、 Mg2+磷酸鹽緩沖液)漂洗2遍，加入3ml胰酶消化液，待細胞消化后加
入2ml培養液。將細胞懸液轉入離心管內，2000 rpm離心5min，棄去上清液，加入 lml含6ug/ml細胞松弛素B的細胞培養液，混合均勻，進行細胞計數并計算出總細 胞數量。加入含6ug/ml細胞松弛素B的細胞培養液調節細胞濃度約0. 1X106細胞 /ml，混合均勻后移取3.5ml至腔式載玻片，培養20h。除去培養液和腔體，用90% 冷甲醇固定玻片10min，移去密封墊，自然晾干或風干。將風干的玻片在10mg/ml 的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配制)中浸泡3min，然后用蒸餾水沖洗玻片30s ，黑暗 處自然晾干或風干。先在低倍鏡(IO倍)下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好 的區域，再在熒光顯微鏡下計數，每個樣品計數500個細胞中含微核(包括單核、 雙核和多核)的細胞數量。
e. 數據處理和分析，評價巻煙主流煙氣基因毒性。
在本發明中，S9混合物是由細胞培養液和NADPH(輔酶II)和S9肝組織勻槳液 配制而成(53%培養液+ 45%NADra + 2%S9 ) 。 6 u g/ml細胞松弛素B的細胞培養 液是由細胞松弛素B和細胞培養液按比例混合配制而成。90%冷甲醇是由蒸餾水和 甲醇按體積比配制并在冰箱(-20° C)保存。10 mg/ml的吖啶橙溶液是由吖啶橙 和D-PBS按比例配制而成。
本發明依據的測試原理在于將培養好的細胞直接置入巻煙主流煙氣中進行 暴露，暴露過的細胞經培養、離心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液熒光染色，再在熒光顯微鏡下計數細胞中含微核的細胞數量，與潔凈空氣暴露的對照樣品比較，判斷巻煙主流煙氣引起細胞微核增加的數量，進而判斷巻煙主流煙氣的基因毒性的大小。
這一實驗設計比較客觀地反映了巻煙主流煙氣的毒性作用，且能定量評價主流煙氣的基因毒性，與現有技術相比具有操作簡單，靈敏度高，結果可靠的特點，開創了 一種新的用于巻煙主流煙氣基因毒性測定的方法。
圖l為試驗過程所用儀器的示意圖。
圖中l為吸煙機，2為流量計，3為泵，4為細胞培養瓶。圖2為實施例l巻煙煙氣引起3T3細胞的微核增加率的柱狀圖。圖3為實施例2巻煙煙氣引起3T3細胞的微核增加率的柱狀圖。圖4為實施例3巻煙煙氣引起3T3細胞的微核增加率的柱狀圖。
具體實施例方式
本發明結合以下實施例做進一步描述，但并不限制本發明。實施例l
對國產某巻煙(盒標焦油15mg)進行評價。樣品巻煙在ISO標準條件下抽吸，抽吸容量為每口35ml，持續時間2s,每分鐘抽吸一口。巻煙燃燒產生的主流煙氣用潔凈的空氣進行稀釋，并調節煙氣總粒相物濃度至41.5 ng/L、 53.8"g/L 、和67.3Pg/L,將稀釋后的煙氣直接導入長有細胞的培養瓶(包括-S9組和+S9組兩組樣品)進行暴露，每個濃度暴露時間為60min。試驗中所用吸煙機與細胞培養瓶連接及煙氣控制方式參見圖l。
此外，將長有細胞的培養瓶(包括-S9組和+S9組兩組樣品)通入潔凈空氣作為對照樣品。暴露結束后，將培養瓶中的培養液換成新鮮的培養液并置于C02培養箱中培養2h。吸出培養液并分別用20 ml預熱的D-PBS漂洗2遍，加入3 ml胰酶消化液，待細胞消化后加入2ml培養液。將細胞懸液轉入離心管內，2000rpm離心5min，棄去上清液，加入lml含6ug/ml細胞松弛素B的細胞培養液，混合均勻，進行細胞計數并計算出總細胞數量。加入含6 y g/ml細胞松弛素B的細胞培養液調節細胞濃度約0.lX10e細胞/ml，混合均勻后移取3.5ml至腔式載玻片，培養20h。除去培養液和腔體，用9(B冷甲醇固定玻片10min，移去密封墊，自然晾干或風干。將風干的玻片在IO mg/ml的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配制)中浸泡3rain，然后用蒸餾水沖洗玻片30s，黑暗處自然晾干或風干。先在低倍鏡(IO倍)下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在熒光顯微鏡下計數，每個樣品計數500個細胞中含微核(包括單核、雙核和多核)的細胞數量。結果見圖2。從圖2可以看出隨著煙氣暴露濃度的增大，巻煙煙氣引起細胞微核的機率顯著增大，呈明顯的劑量-響應關系。
實施例2
本實施例基本同于實施例l，僅是巻煙樣品和煙氣暴露濃度不同。巻煙樣品為盒標焦油8mg國產某巻煙，煙氣暴露濃度為24. 2 " g/L、 50. 6 u g/L和98. 7Pg/L，結果見圖3。
實施例3
本實施例基本同于實施例l，僅是巻煙樣品和煙氣暴露濃度不同。巻煙樣品為盒標焦油9mg進口某巻煙，煙氣暴露濃度為57.5"g/L和90.5ug/L，結果見圖4。
權利要求
1、一種卷煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于該測定方法包括以下步驟將培養好的細胞直接置入經過潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣中進行暴露，暴露過的細胞經培養、離心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液熒光染色，先在低倍鏡下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在熒光顯微鏡下計數，每個樣品計數500個細胞中含微核的細胞數量，與潔凈空氣暴露的對照樣品比較，判斷卷煙主流煙氣引起細胞微核增加的數量，進而判斷卷煙主流煙氣的基因毒性的大小。
2、 根據權利要求l所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于該 測定方法的具體步驟如下a. 細胞培養將測試細胞接種于細胞培養液中，在C02細胞培養箱中37X:下 培養，當細胞繁殖到一定濃度時計數，并將細胞轉移至T-75mL培養瓶中，濃度為 5 . 0X 105-10. 0X 105細胞/瓶，添加培養液至總體積20mL，于0)2細胞培養箱中37°〇 下培養24h;b. +59組細胞培養每個培養瓶吸出IO ml培養液，用這些培養液配制S9混 合物，每個培養瓶加入10ml S9混合物；c. 細胞主流煙氣暴露在ISO標準條件下抽吸巻煙，產生的主流煙氣用潔凈 空氣稀釋，煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物(TPM)濃度為指標進行控制， 稀釋后的煙氣直接導入長有細胞的培養瓶(包括-S9組和+S9組兩組樣品)中進行 主流煙氣暴露，暴露時間為60min，整個暴露過程根據監測的TPM/L值進行控制，正 常對照組(包括-S9組和+S9組兩組樣品)通入潔凈空氣暴露；d. 微核測試暴露過的細胞培養2h后，吸出培養液并分別用20ml預熱的D-PBS 漂洗2遍，加入3 ml胰酶消化液，待細胞消化后加入2ml培養液，將細胞懸液轉入 離心管內，2000rpm離心5min，棄去上清液，加入lml含6 u g/ml細胞松弛素B的細胞培養液，混合均勻，進行細胞計數并計算出總細胞數量，加入含6ug/ml細胞松 弛素B的細胞培養液調節細胞濃度約0.1X106細胞/ml，混合均勻后移取3. 5ml至 腔式載玻片，培養20h，除去培養液和腔體，用9(m冷甲醇固定玻片10min,移去密 封墊，自然晾干或風干，將風干的玻片在IO mg/ml的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配 制)中浸泡3min，然后用蒸餾水沖洗玻片30s ，黑暗處自然晾干或風干，先在低倍 鏡(IO倍)下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在熒光顯微鏡下計 數，每個樣品計數500個細胞中含微核的細胞數量；e.數據處理和分析，評價巻煙主流煙氣基因毒性。
3、 根據權利要求2所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于S9 混合物是由細胞培養液+ NADPH (輔酶II) +59肝組織勻漿液共同組成。
4、 根據權利要求3所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于S9 混合物是由53%培養液+ 45。/。NADPH(輔酶n) + 2呢S9肝組織勻漿液混合而成。
5、 根據權利要求2所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于6 ug/ml細胞松弛素B的細胞培養液是由細胞松弛素B和細胞培養液按比例混合配制 而成。
6、 根據權利要求2所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于90% 冷甲醇是由蒸餾水和甲醇按體積比配制并在冰箱(-20° C)保存。
7、 根據權利要求2所述的巻煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于10 mg/ml的吖啶橙溶液是由吖啶橙和D-PBS按比例配制而成。
全文摘要
一種卷煙主流煙氣基因毒性測定方法，其特征在于先將培養好的細胞直接置入經過潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣中進行暴露，暴露過的細胞經培養、離心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液熒光染色，先在低倍鏡下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在熒光顯微鏡下計數，每個樣品計數500個細胞中含微核(包括單核、雙核和多核)的細胞數量，與潔凈空氣暴露的對照樣品比較，判斷卷煙主流煙氣引起細胞微核增加的數量，進而判斷卷煙主流煙氣的基因毒性的大小。本發明能定量評價卷煙主流煙氣的基因毒性，具有操作簡單，靈敏度高，結果可靠的特點，開創了一種新的用于卷煙主流煙氣基因毒性測定的方法。
文檔編號C12Q1/06GK101580869SQ20091006533
公開日2009年11月18日 申請日期2009年7月1日 優先權日2009年7月1日
發明者盧斌斌, 孫世豪, 宗永立, 鵬 李 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院