專利名稱：一種卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卷煙煙氣體外毒理學(xué)評價研究領(lǐng)域，具體說是一種測試卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性的方法。
背景技術(shù)：
卷煙煙氣的體外毒理學(xué)研究已經(jīng)成為評價吸煙對健康危害的重要手段之一，目前，有關(guān)卷煙煙氣的體外毒理學(xué)研究大多集中于煙氣冷凝物的細(xì)胞毒性和基因毒性方面。如何科學(xué)準(zhǔn)確地評價低危害卷煙產(chǎn)品以及煙草添加劑的危害性，目前國際上還沒有統(tǒng)一的方法和程序。在生物學(xué)實驗研究中，進(jìn)行細(xì)胞存活率的測定是一項關(guān)鍵的試驗技術(shù)。目前進(jìn)行卷煙煙氣細(xì)胞毒性評價時采用的方法大多基于細(xì)胞存活率測定的原理，但相關(guān)的試驗操作步驟較為煩瑣、周期較長。發(fā)展新的測試方法滿足具有敏感性、可靠性、快速、簡便等特點是一種需求。WST-I (一種水溶性四唑鹽)染料是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活率的快速高靈敏度檢測試劑，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜。細(xì)胞增殖越多，則顏色越深；細(xì)胞存活率越低，則顏色越淺。WST-I產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟，同時WST-I染料穩(wěn)定性強，其顏色反應(yīng)時線性范圍寬，靈敏度高，且對細(xì)胞無明顯毒性。卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物體系，且毒性較低，在進(jìn)行煙氣的細(xì)胞毒性評價時，需要靈敏度高的試驗方法；同時在進(jìn)行批量卷煙樣品的毒性測試時也要求測試方法快速、簡便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對上述存在的問題，并基于WST-I染料顏色反應(yīng)的原理以及其自身的優(yōu)點，根據(jù)卷煙煙氣細(xì)胞毒性的特點，建立的一種卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性的測定方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
I)配制實驗試劑有以下幾種
(I)生長培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素。(2) 樣品稀釋培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素。(3) WST-I染液-20 °C保存，臨用前37 1溫育融化，避免發(fā)生沉淀。
(4)陽性對照十二烷基硫酸鈉(SDS) (200 μ g/ml，100%細(xì)胞致死率濃度)。(5)陰性對照2% (v/v) 二甲基亞砜(DMS0)。
2)細(xì)胞接種培養(yǎng)經(jīng)擴增培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞進(jìn)行消化以后，制備細(xì)胞懸液(IXlO5個/ml)。96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。
3)卷煙煙氣染毒使用樣品稀釋培養(yǎng)液將煙氣總粒相物樣品調(diào)整到不同濃度，設(shè)置8個非零濃度。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對照、8個不同劑量的煙氣總粒相物染毒和陽性對照處理，每孔加入100 μ I的含有陰性對照、煙氣總粒相物或陽性對照的稀釋培養(yǎng)液，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液作為空白對照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。
4)WST-I染色煙氣染毒24 h后，每孔加入10 μ I經(jīng)溫育的WST-I染液，細(xì)胞于37°C、5% CO2條件下孵育2 h，室溫下快速振蕩I min，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光值，參考波長為630 nm。
權(quán)利要求
1.一種卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于包括以下步驟 1)配制實驗試劑， 2)細(xì)胞接種培養(yǎng)， 3)卷煙煙氣染毒，4)WST-I 染色， 5)結(jié)果與分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于配制的實驗試劑有以下 (1)生長培養(yǎng)液RPMI-1640+ 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素； (2)樣品稀釋培養(yǎng)液RPMI-1640+ 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU/ml青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素； (3)WST-I染液-20 °C保存，臨用前37 1溫育融化，避免發(fā)生沉淀； (4)陽性對照十二烷基硫酸鈉(SDS)(200 μ g/ml，100%細(xì)胞致死率濃度); (5)陰性對照2%(v/v) 二甲基亞砜(DMSO)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于細(xì)胞接種培養(yǎng)過程如下經(jīng)擴增培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞進(jìn)行消化以后，制備細(xì)胞懸液(IXlO5個/ml);96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于卷煙煙氣染毒過程如下使用樣品稀釋培養(yǎng)液將煙氣總粒相物樣品調(diào)整到不同濃度，設(shè)置8個非零濃度；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對照、8個不同劑量的煙氣總粒相物染毒和陽性對照處理，每孔加入100 μ I的含有陰性對照、煙氣總粒相物或陽性對照的稀釋培養(yǎng)液，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100μ I稀釋培養(yǎng)液作為空白對照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于=WST-I染色過程如下煙氣染毒24 h后，每孔加入10 μ I經(jīng)溫育的WST-I染液，細(xì)胞于37 °C、5% CO2條件下孵育2 h，室溫下快速振蕩I min，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光值，參考波長為630 nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于 結(jié)果與分析如下原$口吸光值 A :A - A45O nm ~~ A630經(jīng)過校正的吸光值A(chǔ)(經(jīng)空自校正)A(經(jīng)空自校正)=A- A(空白)相對吸光值 C :
全文摘要
一種卷煙煙氣體外細(xì)胞毒性測試方法，其特征在于包括以下步驟1)配制實驗試劑，2)細(xì)胞接種培養(yǎng)，3)卷煙煙氣染毒，4)WST-1染色，5)結(jié)果與分析。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下特點在整個試驗過程中減少了多次洗滌細(xì)胞的試驗步驟，操作更為簡便；WST-1染色時無需進(jìn)行更換培養(yǎng)液的步驟，可直接加入稀釋培養(yǎng)液進(jìn)行反應(yīng)；WST-1產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，省去了后續(xù)的溶解步驟，WST-1染色后2h內(nèi)即可完成吸光值檢測，相對于以往的測試方法縮短了測試周期，更加快速。本測定方法還具有操作更快速簡便、靈敏性更高、結(jié)果更穩(wěn)定的優(yōu)點，同時此方法可以適用于多種細(xì)胞系的煙氣細(xì)胞毒性測試。
文檔編號C12Q1/02GK102618619SQ20121008922
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉惠民, 孫學(xué)輝, 尚平平, 李翔, 楊松, 王宜鵬, 聶聰 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院