專利名稱：：提高大豆蛋氨酸含量的人工序列及其植物表達載體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種提高大豆氨基酸含量的人工序列及其植物表達載體。
背景技術：
：蛋氨酸是含硫必需氨基酸，與生物體內各種含硫化合物的代謝密切相關。當缺乏蛋氨酸時，會引起食欲減退、生長減緩或不增加體重、腎臟腫大和肝臟鐵堆積等現象，最后導致肝壞死或纖維化，因此人體需要從食物中補充大量的蛋氨酸。大豆是重要的植物蛋白來源，但是大豆蛋白中含硫氨基酸含量低，嚴重影響大豆的營養品質，培育高含硫氨基酸含量的大豆品種是生產中亟待解決的重大問題。雖然通過對天然儲藏蛋白基因的改造，提高必需氨基酸密碼子比例，或人工設計合成必需氨基酸密碼子多的基因，也是提高作物儲藏蛋白中含硫氨基酸等必需氨基酸含量的有效途徑(wsKim等，2004);但是由于外源基因表達的不穩定性，目前的外源基因還無法實際生產應用；采用蛋氨酸酸代謝調控基因提高大豆蛋氨酸含量的方法由于不同物種之間的差異，一直沒能取得實際、可靠的穩定技術效果。
發明內容本發明的目的是為了解決目前轉基因技術提高大豆蛋氨酸含量的方法都存在穩定性差的問題，而提供的一種提高大豆蛋氨酸含量的人工序列及其植物表達載體。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP的序列如SEQIDNO:1所示。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體包括人工序列HSSP，植物表達載體人工序列HSSP上游包含E12增強子序列和種子特異表達啟動子Pgy2，植物表達載體人工序列HSSP下游包含Tnos終止子序列。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP可高效、穩定的在大豆中表達，提高轉基因大豆的蛋氨酸含量，轉基因大豆株系蛋氨酸含量平均為1.605%，具有實際應用價值。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體能夠在大豆中高效、穩定的表達HSSP基因，從而提高轉基因大豆的蛋氨酸含量。圖1是具體實施方式二中提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的結構圖譜。圖2是具體實施方式二中提高大豆蛋氨酸含量的人工序列在原核生物中表達的SDS-PAGE分析結果圖，圖2中"M"泳道標樣為Marker,"l"泳道標樣為IPTG誘導的BL21(DE3pET-32b)總蛋白，"2"、"3"和"4"泳道標樣為IPTG誘導的BL21(DE3pET-32bS)總蛋白。圖3是具體實施方式四中植物表達載體pBEGH構建圖。圖4是具體實施方式四中T。代轉基因大豆PCR檢測結果圖，圖4中"M"泳道標樣為Marker,"1"泳道標樣為陽性對照，"2"泳道標樣為陰性對照，"3"泳道標樣為抗性植株PBGM1，"4"泳道標樣為抗性植株PBGM2，"5"泳道標樣為抗性植株PBENM1，"6"泳道標樣為抗性植株PBENM2，"7"泳道標樣為抗性植株PBENM3，"8"泳道標樣為抗性植株PBNM1。圖5是具體實施方式四中L代轉基因大豆RT-PCR檢測結果圖，圖5中"M"泳道標樣為Marker,"l"泳道標樣為陽性對照(質粒pUMAPCR擴增產物)，"2"泳道標樣為空白對照，"3"泳道標樣為轉基因植株PBGM1-1-1，"4"泳道標樣為轉基因植株PBGMl-l-2，"5"泳道標樣為轉基因植株PBENM1-1-1，"6"泳道標樣為轉基因植株PBENMl-l-2。圖6是具體實施方式二中Westernblot分析結果圖。圖7是具體實施方式四中PBGM1和PBENM1的T5代轉基因大豆的必需氨基酸的含量圖，圖7中"+"表示人體所需必需氨基酸含量，"X"表示大豆品種綏農14中必需氨基酸含量，"A"表示PBGM1的l代轉基因大豆中必需氨基酸含量，"T"表示PBENM1的T5代轉基因大豆中必需氨基酸含量。具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一本實施方式提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP的序列如下所示具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是人工序列HSSP上游添加omega翻譯增強序列和植物翻譯起始密碼子共有序列kozak，人工序列HSSP下游添加mRNA加尾信號序列和剪切序列。其它步驟及參數與實施方式一相同。本實施方式提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的結構圖譜如圖1所示。本實施方式進行原核表達試驗將本實施方式提高大豆蛋氨酸含量的人工序列構建到原核表達載體pET-32b上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。用液體LB培養基，在37。C條件下活化大腸桿菌BL21(DE3pET-32b)和3株BL21(DE3pET-32b-HSSP)，菌液濃度為0D6。。=0.51.0加入終濃度lmMIPTG(異丙基-13-D-硫代半乳糖苷)，在2(TC培養、誘導蛋白表達4小時；然后提取上述菌體的總蛋白，進行SDS-PAGE分析，分析結果如圖2所示。從圖2中可以看出與BL21(DE3pET-32b)相比3株轉基因大腸桿菌BL21(DE3pET-32bS-HSSP)的總蛋白提取物中均出現了約20KD的條帶，該條帶與人工序列HSSP所編碼的蛋白質分子量基本相符，初步確定人工序列HSSP可在生物體中表達。進行SDS-PAGE電泳，電泳后通過電轉移將蛋白質條帶轉移到PVDF膜上，進行Westernblot實驗，Westernblot分析結果如圖6所示。使用的抗體是Invitrogen公司的Anti-His(C-term)-HRPAntibody,該抗體為蛋白質C端6His的單克隆抗體，與帶有該標簽的融合蛋白能發生免疫結合。圖6中"M"泳道標樣為Marker,"l"泳道標樣為Ni-NTA純化SCMRP基因(高甲硫氨酸蛋白基因)可溶性蛋白，"2"泳道標樣為IPTG誘導的BL21(DE34pET-32b)可溶性蛋白，"3"泳道標樣為IPTG誘導的BL21(DE3pET-32bS)可溶性蛋白，"4"泳道標樣為無IPTG誘導的BL21(DE3pET-32bS)可溶性蛋白。"1"和"3"泳道在20KD處出現雜交信號，而"2"和"4"泳道在20KD處無雜交信號，由此確定人工序列HSSP可在生物體中表達。具體實施方式三本實施方式提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體包括人工序列HSSP，植物表達載體人工序列HSSP上游包含E12增強子序列和種子特異表達啟動子Pgy2，植物表達載體人工序列HSSP下游包含Tnos終止子序列。具體實施方式四結合圖3說明本實施方式，本實施方式按以下步驟構建提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體—、用XbaI和SacI雙酶切質粒pUH，回收640bp片段；二、同時用XbaI和SacI雙酶切載體卡盒pBEGT，回收大片段DNA;三、分別將步驟一和步驟二回收的兩個片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109，篩選、收集轉化子，即得到提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體。對本實施方式獲得提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體進行XbaI和SacI雙酶切，均切出約15kb的載體片段和約0.6kb的插入片段。酶切結果表明構建出了種子特異性植物表達載體PBEGH，在植物表達載體pBEGH中含有目標基因人工序列HSSP，目標基因的上游調控區包括E12增強元件、Pgy2啟動子(大豆球蛋白基因啟動子)、omega增強元件和植物翻譯起始密碼子共有序列(AACAATG);下游包括加尾信號序列、切割序列、polyA序列和Tnos終止子序列。采用農桿菌介導法將提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP轉化大豆品種綏農14，共轉化6株分別為PBGM1、PBGM2、PBENM1、PBENM2、PBENM3和PBNM1。采用PCR方法對轉化的6株大豆的T。代植株進行檢測轉基因大豆檢測引物為MVP-S(CAGCAGGGTCTCGCTTCACT)和MVP-AS(GCAGATTCCAATGCCACAAT)。PCR擴增體系如表1所示。表1TaKaRaTaqlu110XPCRbuffer10u1(25mM)14u1dNTPMixture(各2.5mM)8u1模板DNA4u1MVP-S(20uM)1.5u1MVP-AS(20uM)1.5u1滅菌ddH2060u15擴增反應程序為94t:預變性10min，循環設置為94。C變性30s、6(TC退火30s、72t:延伸50s，共35個循環，72t:延伸10min。T。代轉基因大豆PCR檢測結果如圖4所示，根據檢測結果選取陽性含有人工序列HSSP序列條帶的PBGM1和PBENM1繼續進行1\代和T2代轉基因大豆培育。采用realtimePCR方法對1\代轉基因大豆植株(PBGM1-1和PBENM1-1)進行檢測，證明1\代轉基因大豆植株都正常表達人工序列HSSP。T2代轉基因大豆植株(PBGMl-l-l、PBGM1_1_2、PBENMl-l-l和PBENM1-1-2)開花后30天取豆莢進行RT-PCR檢測，檢測引物為MVP-S和MVP-AS，RT-PCR擴增體系和擴增反應程序與T。代植株檢測相同。RT-PCR檢測結果如圖5所示。RT-PCR檢測結果表明轉基因大豆種子中人工序列HSSP成功表達，說明人工序列HSSP遺傳穩定性高。使用氨基酸分析儀對陽性PBGMl和PBENMl的T5代轉基因大豆進行氨基酸含量分析，PBGMl和PBENMl的T5代轉基因大豆蛋氨酸含量分別為1.60%、1.61%，明顯高于大豆品種綏農14中的1.39%(大豆中各種氨基酸占總氨基酸重量的百分比如表2所示)。按照氨基酸人體需求比例計算，胱氨酸可代替30%蛋氨酸，則PBGMl和PBENMl的T5代轉基因大豆可為人體提供含硫氨基酸分別為2.32%、2.2%，明顯高于大豆品種綏農14中的1.82%，更為接近人體需求的量(2.46%)，PBGMl和PBENMl的T5代轉基因大豆中必需氨基酸的含量(占總氨基酸重量的百分比)如圖7和表3所示。表2AspThrSerGinGlyAlaCysValMetlieLeuTyrPheHisArgProPBG11.3.95.119.4.14.22.14.81.64.58.33.15.32.66.95.46.4Ml1841952161091833566PBE11.3.85.120.4.04.11.94.71.64.59.33.15.42.67.15.46.3麗l1990249203194119449大豆11.3.95.220.3.94.01.54.81.34.68.13.05.52.57.25.16.4品種4455828811927066212綏農14表3(重量百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>〈110〉東北農業大學〈120〉提高大豆蛋氨酸含量的人工序列及其植物表達載體〈160>4〈210>1〈211>453〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1).(453)〈220〉〈223〉提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP?！?00>1ATGGCTGCTAAGATGTTGGCTCTCTTCGCTCTCTTGGCTCTCTGCGCTMetAlaAlaLysMetLeuAlaLeuPheAlaLeuLeuAlaLeuCysAla151015TCAGCTACCTCAGCTACCCATATCCCTGGTCATCTCCCTCCTGTTATGSerAlaThrSerAlaThrHislieProGlyHisLeuProProValMet202530CCCTTGGGAACCATGAACCCTTGCATGCAGTATTGCATGATGCAGCAGProLeuGlyThrMetAsnProCysMetGinTyrCysMetMetGinGin354045GGTCTCGCTTCACTCATGGCTTGCCCTTCTCTCATGCTCCAGCAGTTGGlyLeuAlaSerLeuMetAlaCysProSerLeuMetLeuGinGinLeu505560CTCGCTCTCCCTCTCCAGACTATGCCTGTTATGATGCCTCAGATGATGLeuAlaLeuProLeuGinThrMetProValMetMetProGinMetMet65707580ACCCCTAACATGATGTCTCCTTTGATGATGCCTTCTATGATGTCTCCCThrProAsnMetMetSerProLeuMetMetProSerMetMetSerPro859095ATGGTTCTCCCTTCTATGATGTCTCAGATCATGATGCCTCAGTGCCATMetValLeuProSerMetMetSerGinlieMetMetProGinCysHis100105110TGCGACGCTGTTTCTCAGATTATGTTGCAGCAGCAGTTGCCCTTCATGCysAspAlaValSerGinlieMetLeuGinGinGinLeuProPheMet115120125TTCAACCCTATGGCTATGACCATTCCTCCTATGTTCCTCCAGCAGCCCPheAsnProMetAlaMetThrlieProProMetPheLeuGinGinPro130135140TTCGTTGGTGCTGCTTTCTAA453PheValGlyAlaAlaPhe145150〈210>2〈211>150〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP所編碼的氨基酸序列?！?00>2MetAlaAlaLysMetLeuAlaLeuPheAlaLeuLeuAlaLeuCysAla151015SerAlaThrSerAlaThrHislieProGlyHisLeuProProValMet202530ProLeuGlyThrMetAsnProCysMetGinTyrCysMetMetGinGin354045GlyLeuAlaSerLeuMetAlaCysProSerLeuMetLeuGinGinLeu505560LeuAlaLeuProLeuGinThrMetProValMetMetProGinMetMet65707580ThrProAsnMetMetSerProLeuMetMetProSerMetMetSerPro859095MetValLeuProSerMetMetSerGinlieMetMetProGinCysHis100105110CysAspAlaValSerGinlieMetLeuGinGinGinLeuProPheMet115120125PheAsnProMetAlaMetThrlieProProMetPheLeuGinGinPro130135140PheValGlyAlaAlaPhe145150〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉轉基因大豆檢測引物為MVP-S?！?00>3CAGCAGGGTCTCGCTTCACT20〈210>4〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉轉基因大豆檢測引物為MVP-AS。〈400>4GCAGATTCCAATGCCACAAT209權利要求提高大豆蛋氨酸含量的人工序列，其特征在于提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP的序列如下所示ATGGCTGCTAAGATGTTGGCTCTCTTCGCTCTCTTGGCTCTCTGCGCTTCAGCTACCTCAGCTACCCATATCCCTGGTCATCTCCCTCCTGTTATGCCCTTGGGAACCATGAACCCTTGCATGCAGTATTGCATGATGCAGCAGGGTCTCGCTTCACTCATGGCTTGCCCTTCTCTCATGCTCCAGCAGTTGCTCGCTCTCCCTCTCCAGACTATGCCTGTTATGATGCCTCAGATGATGACCCCTAACATGATGTCTCCTTTGATGATGCCTTCTATGATGTCTCCCATGGTTCTCCCTTCTATGATGTCTCAGATCATGATGCCTCAGTGCCATTGCGACGCTGTTTCTCAGATTATGTTGCAGCAGCAGTTGCCCTTCATGTTCAACCCTATGGCTATGACCATTCCTCCTATGTTCCTCCAGCAGCCCTTCGTTGGTGCTGCTTTCTAA。2.根據權利要求l所述的提高大豆蛋氨酸含量的人工序列，其特征在于人工序列HSSP上游添加omega翻譯增強序列和植物翻譯起始密碼子共有序列kozak，人工序列HSSP下游添加mRNA加尾信號序列和剪切序列。3.如權利要求1所述提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體，其特征在于提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體包括人工序列HSSP，植物表達載體人工序列HSSP上游包含E12增強子序列和種子特異表達啟動子Pgy2，植物表達載體人工序列HSSP下游包含Tnos終止子序列。全文摘要提高大豆蛋氨酸含量的人工序列及其植物表達載體，它涉及一種提高大豆氨基酸含量的人工序列及其植物表達載體。它解決了目前轉基因技術提高大豆蛋氨酸含量的方法都存在穩定性差的問題。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列HSSP的序列如SEQIDNO1所示。本發明提高大豆蛋氨酸含量的人工序列的植物表達載體包括人工序列HSSP，植物表達載體人工序列HSSP上游包含E12增強子序列和種子特異表達啟動子Pgy2，植物表達載體人工序列HSSP下游包含Tnos終止子序列。本發明技術方案可用于培育高蛋氨酸含量的轉基因大豆。文檔編號C12N15/82GK101698841SQ20091007316公開日2010年4月28日申請日期2009年11月10日優先權日2009年11月10日發明者季佐軍,才華,朱延明,李勇,柏錫,紀巍申請人:東北農業大學