專利名稱：擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1和其堿基序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗逆轉錄調控因子AtbZIPl和其堿基序列。
背景技術：
低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫嚴重影響作物的產量與質量，是制約我國農業生 產和亟待解決的重要問題。在對植物逆境信號傳導的研究中發現，轉錄因子發揮著至關重要的作用。 在脅迫 刺激下它們不斷合成，并將信號傳遞和放大，調控下游基因的表達，從而引起植物生理生化 的改變。其中，DREB類和bZIP類轉錄因子是植物中參與非生物脅迫反應的重要的轉錄因 子。DREB類轉錄因子可以和許多脅迫誘導基因上游的DRE/CRT及AREB順式作用元件相結 合，從而調控脅迫誘導基因的表達，如RD17，RD29A，RD29B，C0R15A和C0R15B等。bZIP類轉 錄因子可與脅迫誘導基因上游的AREB元件相結合，參與ABA依賴的信號傳導途徑。Chinnusamy等利用圖位克隆的手段，在擬南芥icel突變體中分離了 ICEl轉錄因 子，編碼一個MYC類的bHLH蛋白，它能與CBF/DREB基因的啟動子結合而激活CBF/DREB的 轉錄。Thomashow等對CBF2上游啟動子序列進行分析發現在CBF2上游-189 -65的區 域含有三個關鍵的蛋白識別位點ICErl (CACATG) XACGTG核心序列、ICEr2 (ACTCCG)。研究 表明，單獨的ICErl或是ICEr2元件對低溫只有微弱的應答反應，而這兩段序列協同作用， 對低溫卻有明顯的應答。ICErl的核心序列包括了 bHLH蛋白的識別位點CANNTG，其可能是 ICEl蛋白的結合位點。但目前還未分離得到能夠與ICEr2元件相結合的轉錄因子，對該元 件的核心序列也沒有科學的驗證。

發明內容
本發明的目的是為了解決目前還未獲得能夠與ICEr2元件相結合的轉錄因子，因 此對ICEr2元件沒有科學的驗證的缺陷，而提供的一種擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 和其堿基序列。本發明擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl具有非生物脅迫抗性，并具有下列氨基 酸序列之一①如SEQ ID NO 1 所示；②在①限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸。上述擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的堿基序列所編碼的擬南芥抗逆轉錄調 控因子AtbZIPl具有非生物脅迫抗性。本發明擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl與ICEr2順式作用元件相互作用可提高 植物抗逆性能。本發明將擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的基因導入植物細胞，可獲得對非生 物脅迫耐受能力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。使用AtbZIPl·構建植物表達載體 時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定和篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物 中表達的選擇性標記基因(GUS基因，熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大 霉素標記物，卡那霉素標記物等)。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基 因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl受多種非生物脅迫誘導，擬南芥抗逆 轉錄調控因子AtbZIPl基因超表達的擬南芥幼苗較野生型植株表現出較高的鹽，滲透， 冷脅迫抗性，但超表達植株幼苗對堿的耐受力較野生型弱。擬南芥抗逆轉錄調控因子 AtbZIPl基因超表達的擬南芥幼苗對ABA處理表現為不敏感，說明擬南芥抗逆轉錄調控因 子AtbZIPl基因通過ABA非依賴途徑提高了植物對干旱，低溫，鹽漬等非生物脅迫的抵抗能力。


圖1是具體實施方式
三中重組酵母不同濃度的SD/-Trp/-His固體培養基上的生 長結果圖，圖2是具體實施方式
四步驟一中重組酵母在含50mM 3-AT的SD/_Hi s/-Leu/-Trp 平板上劃線培養的結果圖，圖3是具體實施方式
五中各陽性轉化子在SD/-Trp和 SD/-Trp/-His培養基上劃線培養的結果圖，圖4是具體實施方式
六中亞細胞定位載體pCEG 的載體圖譜，圖5是具體實施方式
六中擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl在植物細胞內的 亞細胞定位分析的激光共聚焦顯微鏡觀察圖，圖6是具體實施方式
七步驟四中瓊脂糖凝膠 電泳檢測檢測結果圖，圖7是具體實施方式
八步驟一 3中瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測結果圖， 圖8是具體實施方式
四步驟三中擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl突變體重組酵母在含 50mM 3-AT的SD/-His/-Leu/-Trp平板上劃線培養的結果圖，圖9是具體實施方式
四步驟二 1中SDS-PAGE電泳檢測結果圖，圖10是具體實施方式
四步驟二 3的檢測結果圖，圖11是具 體實施方式八步驟二 1中抗鹽實驗結果圖，圖12是具體實施方式
八步驟二 2中抗滲透脅迫 實驗結果圖，圖13是具體實施方式
八步驟二 3中抗低溫脅迫實驗結果圖，圖14是具體實施 方式八步驟二 4中ABA敏感性實驗結果圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl具有非生物脅迫 抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ ID NO 1 所示；②在①限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸。本實施方式中擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的氨基端第13至93位氨基酸殘 基序列為bZIP結構域，在該結構域有一個BR結構域(氨基端第13至38位氨基酸殘基序 列)和一個LZ結構域(氨基端第39至93位氨基酸殘基序列)，屬于Sl亞家族。本實施方式②中取代、缺失或疊加氨基酸的數量在10個以內，且氨基端第16 26 位氨基酸殘基不可缺失。
具體實施方式
二 本實施方式擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的堿基序列所編碼的擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl具有非生物脅迫抗性。本實施方式擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的堿基序列所編碼的擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl可提高植物抗逆性能，并與ICEr2順式作用元件相互作用。在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 所述高嚴謹條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC),0. 1% SDS的溶液，在65 °C下雜交并洗膜。攜帶有本實施方式AtbZIPl基因的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植 物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞 或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
具體實施方式
三本實施方式按以下步驟獲得擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 的基因一.擬南芥cDNA文庫的構建1.擬南芥總RNA的提取和mRNA的分離選取飽滿的野生型擬南芥種子(哥倫比亞生態型)，消毒并春化后播種于1/2MS 培養基上(濾紙橋培養法)，待幼苗生長至22天時，分別對幼苗進行低溫(4°C )，鹽(200mM NaCl)和干旱(30% (W/V)的 PEG6000)處理。用 plant RNAprep Plant Kit(TIANGEN, cat no :DP402)試劑盒提取上述擬南芥幼苗的總RNA，然后用Nucleo Trap mRNA Kits(Clontech, cat no 740655)從上述擬南芥的總RNA中分離出mRNA。2.擬南芥cDNA文庫的構建以步驟1獲得的擬南芥幼苗mRNA為模板，用BD Matchmaker LibraryConstruction & Screening Kits (Clontech, cat no 630445)試劑盒并嚴格按照 試劑盒說明書進行操作構建擬南芥cDNA文庫。二 .用酵母單雜交法從擬南芥cDNA文庫中篩選AtbZIPl基因1. 4mer ICEr2 誘餌載體及 4mer mutant ICEr2 載體的構建l)4mer ICEr2誘餌載體構建在ICEr2順式元件ACTCCG兩端設計保護堿基，5’端加入AGA，3’端加入CGT。并 將加完保護堿基后的序列設計成串聯四聯體。最后根據PHIS2載體上多克隆酶切位點，在 串聯四聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。人工設計合成ICEr2順式作 用元件，序列如下所示ICEr2sense :5，-AATTCAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTGA GCT-3'ICEr2anti-sense :5，-CACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTG -3，將人工合成的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸用50mM NaCl配制成 0. 1 μ g/ μ L的溶液，分別吸取5 μ L的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸溶液加入 0. 2mL離心管中，吹打混勻，94°C變性5min，然后緩慢冷卻至室溫。將IyL T4DNA Ligase Buffer加入一個滅菌的EP管中，加入載體DNA和外源DNA 片段，使摩爾比為1 1，70°C水浴處理lOmin。室溫下加入1 μ LT4DNA連接酶，輕彈外壁混 勻，短暫快速離心，16°C過夜。加入10 μ L IM NaCl并將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，經鑒定獲得誘餌載體pHIS-ICEr2。2)4mer mutant ICEr2 載體構建以ICEr2順式元件ACTCCG為基礎，分別設計兩個突變元件，其中一個是單堿基突 變，即將ACTCCG中的第4位C突變為A ；另一個是完全突變，即將ACTCCG中的A突變為C， T突變為G。同樣，根據PHIS2載體上多克隆酶切位點，在串聯四聯體兩端加入酶切位點，5’ 端為EcoR 1,3'端為SacI。人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件，序列如下所示mlICEr2(單堿基突變)mlICErl-1 :5，-AATTCAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTGAG CT-3'mlICErl-2 :5’ -CACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTG-3，m2ICEr2(完全突變)m21CEr2-1 5，-AATTCAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTGAG CT-3'm2ICEr2-2 :5’ -CACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTG-3，采用上述方法，將突變元件插入到報告質粒載體pHIS2中，分別獲得 pHIS-mlICEr2 和 pHIS_m2ICEr2。2.誘餌載體pHIS_ICEr2的3-AT濃度的選擇采用LiAc法制備酵母感受態細胞，并用小量LiAc/PEG法將誘餌載體pHIS_ICEr2 轉化酵母感受態，將轉化子分別接種到含不同濃度的3-AT的SD/-His/-Trp平板培養基上 30°C培養。發現重組酵母在含有 0mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM 3-AT 的 SD/-Trp/_His 固體培養基上可以生長出一些菌落，而在35mM 3-AT的SD/-Trp/-His固體培養基上只能長 出幾個菌落，在40mM 3-AT的SD/-Trp/-His固體培養基上則不能生長(試驗結果如圖1所 示)。由于過高的3-AT會抑制或殺死剛轉化的酵母細胞，因此，我們把35mM的3-AT濃度作 為抑制酵母HIS3滲漏表達的最適濃度。3.擬南芥cDNA文庫的篩選采用LiAc法制備酵母感受態細胞，并用小量LiAc/PEG法將cDNA文庫， pGADT7-Rec2和pHIS2_ICEr2共轉化酵母AH109，將轉化子接種到含有35mM 3-AT的 SD/-Hi s/-Leu/-Trp 平板培養基上，30°C 培養 3 7 天。用引物 AD-LD sense (5，-CTAT TCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3’)和 AD-LD anti (5，-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTAT CTACGAT-3，)PCR鑒定獲得陽性轉化子。將陽性克隆重新劃線培養，在含50mM 3-AT的 SD/-His/-Leu/-Trp平板上連續分離2 3代(每代30°C倒置培養4 6天)。用BD Yeastmaker Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech, cat no :630441)提取陽性克隆的 質粒并轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，酶切鑒定獲得陽性克隆并送交測序。測序結果表明 通過酵母單雜交獲得了與誘餌載體中ICEr2順式作用元件相結合的文庫蛋白的編碼基因 如SEQ ID No 2所示，由907個堿基組成，其開放閱讀框架為5’端第317 第751位堿基， 編碼具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。對其所編碼的蛋白進行氨基 酸殘基序列分析，發現其氨基端第13至93位氨基酸殘基序列為bZIP結構域，在該結構域 有一個BR結構域(氨基端第13至38位氨基酸殘基序列)和一個LZ結構域(氨基端第39 至93位氨基酸殘基序列)，屬于Sl亞家族。
具體實施方式
四本實施方式按以下步驟進行擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 與ICEr2元件的結合特異性分析一 .擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl在酵母細胞內與ICEr2元件的結合特異性 分析從上述測序正確地陽性克隆中分離得到pGADT7-Rec2-bZIPl載體。將重組載體 pHIS-mlICEr2 或 pHIS_m2ICEr2 和 pGADT7_Rec2_bZIPl 共轉化酵母菌株 AH109,并通過 PCR 鑒定分別得到重組酵母AH109/mlICEr2/bZIPl和AH109/m2ICEr2/bZIPl。分別將重組酵母 AH109/ICEr2, AH109/ICEr2/bZIPl, AH109/mlICEr2/bZIPl 和 AH109/m2ICEr2/bZIPl 在含 50mM 3-AT的SD/-His/-Leu/-Trp平板上劃線，30°C培養3 7天，結果如圖2所示，只有重 組酵母AH109/ICEr2/bZIPl能夠正常生長，而其余重組酵母生長都受到明顯抑制。該結果 表明AtbZIPl在酵母體內能夠特異性結合ICEr2元件，從而激活報告基因HIS3的表達。
二 .擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl與ICEr2元件的體外結合的功能性分析1.擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl重組蛋白的獲得將擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl基因的全長⑶S區克隆到原核表達載體 pET32b (Novagen)中，并將重組表達載體轉化Ε. coli BL21，在37°C下經0. ImM IPTG誘導表 達2 3h，將表達產物進行SDS-PAGE電泳檢測，結果表明AtbZIPl重組蛋白得到表達。采 M ProBond Purification System(Invitrogen, cat no :K850-01) X^iiW AtbZIPl MM 蛋白進行純化，并進行SDS-PAGE電泳檢測(檢測結果如圖9所示)，-20°C保存，用于凝膠 阻滯實驗(EMSA)。2. ICEr2元件的地高辛標記采用 Roche 公司的 DIG DNA Labeling and Detection Kit (cat no 1093657)對 ICEr2元件進行地高辛標記。將人工合成的ICEr2元件正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷 酸溶液(0. lyg/yL)各取8yL置于0. 2mL離心管中，95°C變性lOmin，緩慢冷卻至室溫 使其退火，然后加入4yL檢測試劑盒中的隨機引物標記試劑，其中含有Hexanucleotide mixture, Klenow enzyme 和 dNTIP lablingmixture，37°C反應過夜，4°C保存備用。3. AtbZIPl蛋白與DNA結合反應及非變性SDS-PAGE檢測在15 μ L結合反應體系中含標記的探針1 μ L，AtbZIPl純化蛋白8 μ L，小牛胸腺 DNA lyL，10X結合緩沖液1.5yL和ddH20 3. 5 μ L，將其混合后25°C反應30min。其中 IOX結合緩沖液的成分如下=TriS-HCl (pH值為7. 6)濃度為20mmol/L，KCl濃度為30mmol/ L, Tween 20 濃度為 0. 2% (ff/V), EDTA 濃度為 lmmol/L，DTT 濃度為 lmmol/L，(NH4)2SO4 濃度 為lOmmol/L。然后加入3 μ L上樣緩沖液(含0. 025%溴酚藍的無菌水)，進行非變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳檢測。5%聚丙烯酰胺凝膠的配方為30%丙烯酰胺(1.2mL)，5X電泳緩沖 液 TBE (0. 75mL), 10% APS (52. 5 μ L)，TEMED (5 μ L)，ddH20 (5. 2mL)。待膠凝好后，用 1 X 電 泳緩沖液TBE預電泳15min (42V)，然后上樣，繼續電泳3h (電壓為42V)。電泳結束后，仔細 移去上層玻璃板，將與膠大小相同的帶正電荷的干燥尼龍膜(Milipore)直接鋪在膠上，用 玻璃棒趕走氣泡，然后放置三層濾紙，再次趕走氣泡。最后壓上200g以上得重物，轉膜lh。 轉膜后，仔細除去膜上粘著的膠塊，將膜夾在兩層濾紙之間，120°C烘干30min以固定DNA或 DNA-蛋白復合物。然后將膜在沖洗緩沖液中洗1 5min，于20mL封閉液中溫浴30min，加入 抗體4 μ L，在沖洗緩沖液中洗2次，每次15min，然后再20mL檢測緩沖液中平衡2 5min，最后在顏色反應液中黑暗溫浴，直至出現可見的清晰條帶。結果如圖10所示，僅有ICEr2 元件時沒有條帶(如圖10中的“2”泳道)，當加入目的蛋白后出現了一條明顯的滯后條帶 (如圖10中的“3”泳道)，說明在體外AtbZIPl蛋白仍能夠與ICEr2元件結合。三.擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl突變體與ICEr2元件的體內結合以 pGADT7-Rec2-bZIPl 質粒為模板，PCR擴增 AtbZIPl 突變體 bZl、bZ2、bZ3 和 bZ4。 其中，bZl突變體缺失擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl氨基端第3 12位氨基酸殘基， bZ2突變體缺失擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl氨基端第16 26位氨基酸殘基，bZ3突 變體將擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl氨基端第15 18位氨基酸殘基Glu-Lys-Lys替 換為Gly-Pro-Arg，bZ4突變體在擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl氨基端第15位氨基酸 殘基Glu之前添加了 Gly-Pro-Arg三個氨基酸殘基。將AtbZIPl突變體bZl、bZ2、bZ3和 bZ4 分別連接入 pGADT7 載體得到 pGADT7_bZl，pGADT7_bZ2，pGADT7_bZ3，和 pGADT7_bZ4。 將上述載體分別與pHIS2-ICEr2共轉化酵母菌株AH109，并通過PCR鑒定分別得到重組 酵母 AH109/ICEr2/bZl，AH109/ICEr2/bZ2, AH109/ICEr2/bZ3 和 AH109/ICEr2/bZ4。將以 上重組酵母和重組酵母AH109/ICEr2 (陰性對照)，AH109/ICEr2/bZIPl (陽性對照)分別 在SD/Trp/Leu/His液體培養基中搖菌，將菌液稀釋100倍后，并將每0. 5 μ L菌液滴到含 50mM 3-AT的SD/Trp/Leu/His固體培養基上，30°C培養3 7天，結果如圖8所示，重組酵 母 AH109/ICEr2/bZIPl (陽性對照)，AH109/ICEr2/bZl，AH109/ICEr2/bZ3 和 AH109/ICEr2/ bZ4都可以正常生長，而重組酵母AH109/ICEr2/bZ2和AH109/ICEr2 (陰性對照)都不能生 長。結果表明氨基端第16 26位氨基酸殘基的缺失后，AtbZIPl缺失突變體在酵母體內 不能與ICEr2元件結合。通過對AtbZIPl結構分析表明該區域位于其BR結構域中，該區域 是AtbZIPl與ICEr2元件結合的區域。
具體實施方式
五本實施方式按以下步驟進行擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 在酵母體內的轉錄激活實驗將擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl基因全長⑶S區克隆到酵母表達載體 PGBKT7 (Trp+)中，得到重組酵母表達載體命名為pGBKT7_bZIPl，然后采用小量LiAc/PEG 法將pGBKT7-bZIPl，pGBKT7(陰性對照)，PGBKT7_DREB1C (陽性對照)分別轉化酵母菌株 AH109,經PCR鑒定得到陽性轉化子。分別將各陽性轉化子在SD/-Trp和SD/-Trp/-His培 養基上劃線培養，培養結果如圖3所示，所有酵母細胞都能夠在SD/-Trp培養基上正常生 長；含有pGBKT7-bZIPl的酵母細胞，和陽性對照PGBKT7-DREB1C —樣可以在SD/-Trp/_His 選擇培養基上生長，而陰性對照則不能正常生長。說明AtbZIPl具有自激活能力，可以激 活下游報告基因HIS的表達，從而讓可以在SD/-Trp/-His選擇培養基上生長。進一步 藍白斑實驗也證實了這一點。將SD/-Trp培養基上重組酵母細胞采用濾紙影印法影印到 Whatman濾紙上，將濾紙放入液氮中15s，然后恢復到室溫使細胞裂解，然后將濾紙浸潤在 2. 5mLZ-buffer/X-GAL溶液中，30°C培養觀察藍白斑。其中，Z-buffer (pH值為7. 0)主要 成分為 Na2HPO4 · 7H20 濃度為 16. lg/L，NaH2PO4 · H2O 濃度為 5. 50g/L, KCl 濃度為 0. 75g/ L, MgSO4 · 7H20 濃度為 0. 246g/L。Z-buffer/X-GAL 溶液的主要成分為20mL Z-buffer、 0. 054mL β-巰基乙醇和67 μ L 20mg/mL X-GAL stocksolution。試驗結果結果說明含有 pGBKT7-bZIPl的酵母細胞和陽性對照PGBKT7-DREB1C能夠產生藍斑，而陰性對照則不能產 生藍斑，進一步說明擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl在酵母體內的具有轉錄激活特性。
具體實施方式
六本實施方式按以下步驟進行擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 在植物細胞內的亞細胞定位分析將擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl基因全長⑶S區克隆到亞細胞定位載體 pCEG(載體圖譜如圖4所示)，得到AtbZIPl亞細胞定位載體pCEG_bZIPl。采用凍融法將 pCEG-bZIPl，pCEG(陰性對照)和pCEG_bZIP24(陽性對照)分別轉化農桿菌EHA105，PCR 鑒定得到陽性轉化子。用重組農桿菌浸潤煙草葉片，過渡培養3天后，用激光共聚焦顯微鏡 (SP5 ；Leica,Germany)觀察488nm下熒光信號，結果如圖5所示，說明擬南芥抗逆轉錄調控 因子AtbZIPl蛋白定位于細胞核，與陽性對照pCEG-bZIP24定位相同，而陰性對照pCEG則 無定位傾向。
具體實施方式
七本實施方式按以下步驟進行擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 在非生物脅迫條件下的表達特性分析
一、擬南芥幼苗的處理選取飽滿的野生型擬南芥種子(哥倫比亞生態型)，用體積濃度為5%的次氯酸鈉 消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播種于1/2MS培養基上(濾紙橋培養法)，待幼 苗生長至22天，進行下述不同條件的處理1)鹽處理用濃度為2001111的恥(1溶液處理幼苗，分別處理011，111，311，611，1211， 24h，分別取處理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者 直接提取RNA。2)模擬干旱處理用30% (ff/V)PEG6000溶液處理幼苗，分別處理0h，lh，3h，6h， 12h，24h，分別取處理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用 或者直接提取RNA。3)低溫處理將幼苗置于4°C冷藏柜中進行低溫處理，分別處理0h，lh，3h，6h， 12h，24h，分別取處理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用 或者直接提取RNA。二、擬南芥幼苗的RNA提取及基因組DNA的去除1.取經上述步驟一不同方法處理后的擬南芥幼苗材料各lOOmg，液氮研磨，用 plant RNAprep Plant Kit (TIANGEN, cat no :DP402)試劑盒并參照試劑盒說明書提取RNA。2.采用TaKaRa公司的DNase I于37°C反應20 30min，去除RNA中的基因組DNA。 反應體系如下RNA 40 μ L, IOXDNase I Buffer 5 μ L, DNaseI 2 μ L, RNAase Inhibitor 0. 5μ L, RNAase-free ddH20 2· 5 μ L03.加入50 μ L的酚氯仿抽提一次，取上清，用等體積的異丙醇沉淀RNA，用體積濃 度為70%乙醇洗沉淀2次，將RNA溶于40 μ L無菌RNAase-freeddH20。4.通過電泳和紫外分光光度計檢測RNA的濃度和完整度。三、RT-PCR法統一模板DNA濃度1. mRNA的反轉錄以步驟二提取的經不同處理的擬南芥幼苗的RNA為模板，采用 ReverseTranscriptase M-MLV RNase H-(TaKaRa, cat no :D2639A)試劑盒反轉錄合成 cDNA。取RNA 5yL, Oligo dT 1 μ L，混勻后70°C變性lOmin，迅速置于冰上冷卻，然后加 Λ 5XM-MLV Buffer 2 μ L, dNTP (IOmM) 0. 5 μ L, M-MLV ReverseTranscriptase 0. 25 μ L,RNAase Inhibitor 0. 25 μ L, RNAase-free ddH20 1 μ L,混勻后 42 "C 保溫 lh，70 "C 保溫 15min，4°C儲存備用。2.模板cDNA的含量調平根據GenBank上登錄的擬南芥肌動蛋白基因(Accession·. AT3G18780)設計如下 引物Actin sense 5’ -CCTCCGTCTTGACCTTGC-3’Actin antisense :5， -AGCGATACCTGAGAACATAGTG-3，以步驟三1中獲得的經不同處理的擬南芥幼苗的cDNA為模板，PCR擴增擬南芥內 參基因內參基因(肌動蛋白基因)，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后根據PCR產物的電泳 結果對模板cDNA進行稀釋，調整模板cDNA的用量，直至內參基因擴增出的DNA條帶的量基 本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。四、AtbZIPl基因的擴增根據AtbZIPl基因序列設計引物，序列如下AtbZIPl sense 5， -TCTTGATCCTCGCAAAATCACAG-3，AtbZIPl antisense :5， -GTACGTCTACAATCTCCAACCGCTA-3，以步驟三統一濃度后的經不同處理的擬南芥幼苗的cDNA為模板，PCR擴增擬南芥 AtbZIPl基因，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測結果如圖6所示，表 明AtbZIPl基因的表達受鹽，干旱和低溫的誘導。
具體實施方式
八本實施方式按以下步驟進行擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl 基因的擬南芥轉化及轉基因植株的生理分析實驗一 .擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl基因的擬南芥轉化及轉基因植株的檢測1. AtbZIPl基因的植物表達載體的構建及農桿菌的轉化通過PCR擴增在AtbZIPl基因的全長⑶S區兩側分別引入Swa I和SmaI酶切位 點，與酶切后的PreC1008載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α，經PCR檢測與酶切鑒定，得到植 物表達載體，命名為PreC1008-bZIPl，并送交測序。將測序正確的陽性克隆轉化至農桿菌 LBA4404,并PCR鑒定得到陽性轉化子，用于侵染擬南芥植株。2. AtbZIPl基因的擬南芥轉化1)擬南芥的培養將擬南芥種子(哥倫比亞生態型)4°C春化3 7天后，播種于營養缽中(營養土、君子蘭土和蛭石按1 1 1的體積比混合)，置于溫室中培養(22°C，光照16h/天)，待擬 南芥抽出出生苔后，剪去出生苔，待其抽出更多的次生苔且花開較盛時，可用于下述轉化。2)農桿菌的培養挑取轉化有PreC1008_bZIPl的重組農桿菌單菌落接種于5mL YEB (利福平的濃度 為50mg/L、鏈霉素的濃度為50mg/L、氯霉素的濃度為80mg/L)液體培養基中，28°C 230r/min 培養30h，按1 100體積比轉接入500mL新鮮的YEB(利福平的濃度為50mg/L、鏈霉素的 濃度為50mg/L、氯霉素的濃度為80mg/L)液體培養基中，28°C 230r/min培養16 24h，測 得0D600 1.5 ；4°C、5000r/min離心IOmin收集菌體，然后重懸于500mL質量濃度為5% 蔗糖溶液(含0.02% silwet-77)中。3)轉化擬南芥
將已經結夾的花蕾剪掉，把花序倒置浸入步驟2)所得的含有重組農桿菌的蔗糖 溶液中30s，轉化完畢后，將植株套上塑料袋保濕，水平放置于低光強度下生長24h，即可正 常培養。一周后，重復侵染一次，可提高轉化效率。4)收集種子進行篩選將侵染后所收集的種子進行消毒春化后，播種于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固體 培養基上。待種子萌發后，將綠色的陽性植株(TO代)移栽至營養缽(營養土、君子蘭土和 蛭石按1 1 1的體積比混合)中培養，并收 集種子進行T1代篩選。3.轉基因擬南芥的PCR檢測采用CTAB法提取轉基因擬南芥植株的基因組DNA，并根據PreC1008中HPT II基 因序列設計引物，引物序列如下HPT sense 5， -GTTTGTTTGGTTGCCTTTGC-3，HPT antisense :5， -GCGTGTCAGCGTATCTATTCA-3，以轉基因擬南芥的基因組DNA為模板，PCR擴增HPT II基因，并進行瓊脂糖凝膠 電泳，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖7所示，轉基因植株同陽性對照一樣，都擴增出了約 1300bp的目的條帶。二 . AtbZIPl轉基因擬南芥的生理分析實驗1.抗鹽實驗選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)和AtbZIPl超量表達擬南芥種子， 用5%次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播種于含有IOOmMNaCl的1/2MS 固體培養基上，兩周后觀察表型(結果如圖11所示)。AtbZIPl超量表達擬南芥幼苗的根 長比野生型植株長，葉子也比野生型植株大，說明AtbZIPl超量表達擬南芥植株具有更強 的抗鹽能力。2.抗滲透脅迫實驗選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)和AtbZIPl超量表達擬南芥種子， 用體積濃度為5%的次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播種于含有200mM 甘露醇的1/2MS固體培養基上，兩周后觀察表型(結果如圖12所示)。AtbZIPl超量表達 擬南芥幼苗的生長狀態要比野生型植株好，具有較長的根和較大的葉子，說明AtbZIPl能 夠提高植株的抗滲透脅迫能力。3.抗低溫脅迫實驗選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)和AtbZIPl超量表達擬南芥種子， 用5%次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播種于V2MS固體培養基上， 置于4°C培養，兩周后觀察表型(結果如圖13所示)。AtbZIPl超量表達擬南芥幼苗的生 長狀態要比野生型植株好，具有綠色的葉子，而野生型擬南芥的葉子已經變成紫色，說明 AtbZIPl能夠提高植株的抗低溫脅迫能力。4. ABA (脫落酸)敏感性實驗選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)和AtbZIPl超量表達擬南芥種子， 用5%次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播種于含有0. 5 μ m ABA的1/2MS 固體培養基上，兩周后觀察表型(結果如圖14所示)。AtbZIPl超量表達擬南芥和野生型 擬南芥幼苗的生長都受到了明顯的抑制，超量表達擬南芥植株并未表現出更強的抗性。說明AtbZIPl能夠提高植株的抗低溫脅迫能力。序列表<110>東北農業大學<120>擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl和其堿基序列<160>17<210>1<211>145<212>PRT<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Ala Asn Ala Glu Lys Thr Ser Ser Gly Ser Asp lie Asp Glu Lys151015Lys Arg Lys Arg Lys Leu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg202530Leu Lys Lys Gln Lys Leu Met Glu Asp Thr lie His Glu lie Ser Ser354045Leu Glu Arg Arg lie Lys Glu Asn Ser Glu Arg Cys Arg Ala Val Lys505560Gln Arg Leu Asp Ser Val Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Ser Glu65707580Lys lie Trp Leu Ser Ser Tyr Val Ser Asp Leu Glu Asn Met lie Ala859095Thr Thr Ser Leu Thr Leu Thr Gln Ser Gly Gly Gly Asp Cys Val Asp100105110Asp Gln Asn Ala Asn Ala Gly lie Ala Val Gly Asp Cys Arg Arg Thr115120125Pro Trp Lys Leu Ser Cys Gly Ser Leu Gln Pro Met Ala Ser Phe Lys130135140Thr145<210>2<211>907<212>DNA<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2TTCTCCCACT TTCCTTATTT TCGATCTTAT CCTTATCTTC TTCCTTGTTC TATTTCTCTT 60CTAACTAATC TCTTCTCTTC TCTTAAAATC AAACGTAATC ATAAATAAAG ATCTTCTTGT 120TTAATTTCTC TTGATCCTCG CAAAATCACA GATTCTTGAA ATTCTTTTTT CTTGTCTTGA 180
AATTCTTGAG TTCTTGAGTT ATGAAAAGAC AATGGACAGA GTTATGAAAT GATAAATCTC 240
AACCAATTCC TTGTTTATCA TTCTATATCA GTTGTGATTC TTCATTGGTT TTACGTTATC 300TCTTGAACAA AAAAACATGG CAAACGCAGA GAAGACAAGT TCAGGTTCCG ACATAGATGA 360GAAGAAAAGA AAACGCAAGT TATCAAACCG CGAATCTGCA AGGAGGTCGC GTTTGAAGAA 420ACAGAAGTTA ATGGAAGACA CGATTCATGA GATCTCCAGT CTTGAACGAC GAATCAAAGA 480GAACAGTGAG AGATGTCGAG CTGTAAAACA GAGGCTTGAC TCGGTCGAAA CGGAGAACGC 540GGGTCTTAGA TCGGAGAAGA TTTGGCTCTC GAGTTACGTT AGCGATTTAG AGAATATGAT 600TGCTACGACG AGTTTAACGC TGACGCAGAG TGGTGGTGGC GATTGTGTCG ACGATCAGAA 660CGCAAACGCG GGAATAGCGG TTGGAGATTG TAGACGTACA CCGTGGAAAT TGAGTTGTGG 720TTCTCTACAA CCAATGGCGT CCTTTAAGAC ATGAGATTTG TGTATTAGTG TGTGTTTTAC 780TTTGGTCATT TTATAGTTTT TGTAATCTTT TTATATCGAA TTGTTTCTTC TCATTACTTT 840CTGAATTCTG ATACAATTGC ATATCTTATT GTTTTCAACA TTTTCATTTA ACGTTATATG 900ATTTTCG 907<210>3<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成ICEr2順式作用元件ICEr2 sense序列。<400>3AATTCAGAAC TCCGCGTAGA ACTCCGCGTA GAACTCCGCG TAGAACTCCG CGTGAGCT 58<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成ICEr2順式作用元件ICEr2 anti-sense序列。<400>4CACGCGGAGT TCTACGCGGA GTTCTACGCG GAGTTCTACG CGGAGTTCTG 50<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件mlICEr2 (單堿基突變)序列。<400>5AATTCAGAAC TACGCGTAGA ACTACGCGTA GAACTACGCG TAGAACTACG CGTGAGCT 58<210>6<211>58<212>DNA
<213>人工序列<220><223>人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件mlICErl_l序列。<400>6AATTCAGAAC TACGCGTAGA ACTACGCGTA GAACTACGCG TAGAACTACG CGTGAGCT 58<210>7<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件mlICErl_2序列。<400>7CACGCGTAGT TCTACGCGTA GTTCTACGCG TAGTTCTACG CGTAGTTCTG 50<210>8<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件m2ICEr2_l (完全突變)序列。<400>8AATTCAGACA GAATCGTAGA CAGAATCGTA GACAGAATCG TAGACAGAAT CGTGAGCT 58<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工設計合成的突變ICEr2順式作用元件m2ICEr2_2 (完全突變)序列。<400>9CACGATTCTG TCTACGATTC TGTCTACGAT TCTGTCTACG ATTCTGTCTG 50<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>擬南芥cDNA文庫的篩選陽性轉化子PCR鑒定引物AD-LD sense序列。<400>10CTATTCGATG ATGAAGATAC CCCACCAAAC CC 32<210>11
<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220><223>擬南芥cDNA文庫的篩選陽性轉化子PCR鑒定引物AD-LD anti序列。
0238]<400>11GTGAACTTGC GGGGTTTTTC AGTATCTACG AT 32<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據GenBank上登錄的擬南芥肌動蛋白基因設計的引物Actin sense的序 列。<400>12CCTCCGTCTT GACCTTGC 18<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據GenBank上登錄的擬南芥肌動蛋白基因設計的引物Actin antisense 的序列。<400>13AGCGATACCT GAGAACATAG TG 22<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtbZIPl基因序列擴增引物AtbZIPl sense的序列。<400>14TCTTGATCCT CGCAAAATCA CAG 23<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtbZIPl 基因序列擴增引物 AtbZIPl antisense 的序列。<400>15
GTACGTCTAC AATCTCCAAC CGCTA 25<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據pFGC1008中HPT II基因序列設計引物HPT sense的序列。<400>16GTTTGTTTGG TTGCCTTTGC 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據pFGC1008中HPT II基因序列設計引物HPT antisense的序列。<400>17GCGTGTCAGC GTATCTATTC A 2權利要求
擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1，其特征在于擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1具有非生物脅迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ ID NO1所示；②在①限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸。
2.如權利要求1所述擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的堿基序列，其特征在于擬南 芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl的堿基序列所編碼的擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIPl具有 非生物脅迫抗性。
全文摘要
擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1和其堿基序列，它涉及一種抗逆轉錄調控因子AtbZIP1和其堿基序列。它解決目前還未獲得能夠與ICEr2元件相結合的轉錄因子，因此對ICEr2元件沒有科學的驗證的缺陷。擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1具有非生物脅迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ IDNO1所示；②在①限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸。擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1的堿基序列所編碼的擬南芥抗逆轉錄調控因子AtbZIP1具有非生物脅迫抗性。本發明可用于轉基因工程。
文檔編號C12N15/11GK101812123SQ20091007319
公開日2010年8月25日 申請日期2009年11月12日 優先權日2009年11月12日
發明者孫曉麗, 季佐軍, 才華, 朱延明, 李勇, 柏錫, 紀巍 申請人:東北農業大學