專利名稱：：一種永生化人肝細胞系及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物學領域，具體涉及一種永生化人肝細胞系及其制備方法和該永生化人肝細胞系在制備生物人工肝和制備治療肝功能衰竭藥物中的應用。
背景技術：
：肝移植是治療終末期肝功能衰竭的唯一有效方法。但是，由于肝供體器官來源非常有限，大多數急性肝功能衰竭的病人往往在等待肝移植供體期間死亡。因此，建立一種生物人工肝支持系統，重建基本的肝臟功能是治療急性肝功能衰竭的一種新技術，不僅可提高肝衰竭患者的生存率，而且為患者進行肝移植贏得時間。生物人工肝技術是利用具有部分或全部肝細胞活性的細胞裝置在生物反應器中，通過該系統中的肝細胞將患者血漿中的毒性物質進行代謝，從而起到替代肝臟功能的效果。生物人工肝中的核心部分是生物反應器。生物反應器一般由生物活性細胞和提供生物活性細胞生長及代謝環境的支持系統構成。生物反應器中使用的細胞性質和功能是決定生物人工肝功能效果的主要因素。目前生物反應器所使用的生物活性細胞主要是新鮮的豬肝細胞(DonatoMT,CastellJV,Gomez-LechonMJ.Characterizationofdrugmetabolizingactivitiesinpighepatocytesforuseinbioartificialliverdevices:comparisonwithotherhepaticcellularmodels.JHepatol,1999;31(3):542-549)和人的肝細胞瘤細胞(CourtFG,Wemyss-HoldenSA,DennisonAR,Bioartificialliversupportdevices:historicalperspectives.ANZJSurg，2003Sep;73(9):739-48)。由于豬肝細胞的細胞色素P450含量及混合氧化酶活性與人肝細胞接近，且具備較好的代謝膽紅素與清除血氨的功能，加之豬細胞來源廣泛，價格低廉，因此被應用作為生物人工肝的細胞材料(DonatoMT,CastellJV,Gomez-LechonMJ.Characterizationofdrugmetabolizingactivitiesinpighepatocytesforuseinbioartificialliverdevices:comparisonwithotherhepaticcellularmodels.JHepatol,1999;31(3):542-549)。現已證明采用豬肝細胞制備生物人工肝存在兩大突出問題1、由于種屬差異而導致免疫排斥反應的發生。盡管生物人工肝系統中常規采用半透膜進行免疫阻隔，但高滴度的抗豬IgM和IgG抗體，仍然可在接受2次以上豬肝細胞型生物人4工肝治療者的血中檢出，提示接受治療者暴露于豬肝抗原的情況仍然存在(BaquerizoA,MhoyanA,Kearns-JonkerM,etal.Characterizationofhumanxenoreactiveantibodiesinliverfailurepatientsexposedtopighepatoytesafterbioartificiallivertreatment:anexvivomodelofpigtohumanxenotransplantation.Transplantation，1999;67(1):5-18)。2、動物攜帶病毒的感染。研究顯示豬的體內普遍存在豬源性逆轉錄病毒(porcineendogenousretroviral,PERV)和其他人畜共患病毒，這些病毒可能在生物人工肝治療過程中傳染給患者。有研究表明，PERV可以通過人與豬細胞的體外混合培養而進行轉導，并且可在新的宿主細胞內復制(vanderLaanLJ,LockeyC，GriffethBC,etal.InfectionbyporcineendogenousretrovirusafterisletxenotransplantationinSCIDmice.Nature,2000;407(6800):90-94)。另一種嘗試用于生物人工肝的細胞材料是人肝腫瘤細胞，如低度惡性的肝癌細胞株，C3A細胞(CourtFG，Wemyss-HoldenSA,DennisonAR,Bioartificialliversupportdevices:historicalperspectives.ANZJSurg,2003Sep;73(9):739-48)。由于這種細胞存在致瘤性，生物安全性難以充分保證，并且細胞的生物活性較低，功能上難以令人滿意，故至今未能在生物人工肝制備中廣泛應用。理想的生物人工肝細胞材料應該是人源性、表型正常(非惡性)、容易獲得、具有正常肝細胞的解毒功能(HoofnagleJH,CarithersRLJr,ShapiroC,etal.Fulminanthepaticfailure:summaryofaworkshop.Hepatology,1995;21(l):240-252)。人的肝細胞就其生物學功能及免疫學特性而言無疑是為最理想的生物人工肝細胞材料。但由于其來源受到供肝缺乏的限制，而且在體外培養條件下很難增殖。因此，國內外技術人員試圖利用永生化技術建立人源化肝細胞系來解決生物人工肝細胞材料的來源問題。但是，到目前為止，國內外所建立的幾種永生化肝細胞系例如OUMS29(KobayashiN，NoguchiH,FujiwaraT,etal.Establishmentofahighlydifferentiatedimmortalizedadulthumanhepatoytecelllinebyretroviralgenetransfer.TransplantPro.2000;32(7):2368-2369)、HepZ(WernerA，D職rS，MuthingJ，etal.Cultivationandcharacterizationofanewimmortalizedhumanhepatocytecellline,HepZ，foruseinanartificialliversupportsystem.AnnNYAcadSci,1999;875:364-368)等都表現出不同程度的肝細胞功能缺陷，因此還未見有人源化永生化化肝細胞系應用于生物人工肝制備的文獻報道。除了肝細胞本身因素外，影響生物人工肝功能的另一個重要因素是裝載于生物反5應器中的肝細胞數量。生物人工肝所需的肝細胞數量可高達1(^10"之多(Hoekstra,R.，Chamuleau,R.A.Recentdevelopmentsonhumancelllinesforthebioartificialliver.Int.J.Artif.Organs2002;25:182-191)，在短時間內僅僅依靠平面培養技術獲得數量如此巨大的人肝細胞是很困難的。
發明內容本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種永生化人肝細胞系及其制備方法。該永生化人肝細胞系具有原代人肝細胞的主要功能，并且在體外大規模培養該細胞系。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案本發明提供一種永生化人肝細胞系，該永生化人肝細胞系IHH已于2009年8月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo.3210。保藏地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。所述永生化人肝細胞系的制備方法通過慢病毒載體向原代分離的人正常肝細胞中轉染SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因，利用克隆法篩選獲得永生化人肝細胞系。所述永生化人肝細胞系的制備方法通過慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT向原代分離的人正常肝細胞中轉染SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因，其中所述慢病毒載體pWPT-SV40Tag或pWPT-hTERT是分別將SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因插入到慢病毒載體pWPT的多克隆位點得到的重組載體。其中，所述慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT按照如下方法將SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因導入到人正常肝細胞中分別構建含有SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因的慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT;然后包裝成具有感染能力但復制缺陷的帶有SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因的慢病毒顆粒；再感染人正常肝細胞。上述人正常肝細胞為人成體肝細胞。經過鑒定，本發明所述永生化人肝細胞系具有以下主要特性及功能(1)具有明顯的體外增殖活性，細胞在體外以二倍體方式增殖，采用我們的肝細胞培養基進行體外培養，其細胞倍增時間為27-32小時。此細胞已經過180代以上的培養，其增殖活性沒有明顯改變。(2)永生化人肝細胞系表達肝細胞的功能性分子，包括代謝膽紅素的膽紅素二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶(bilirubin-uridinediphosphate-glucuronosyltransferase，UGT)，4戈謝氨的谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)，解毒和生物轉化功能的谷胱甘肽轉移酶兀(glutathione-S-transferase兀，GST);細胞合成并分泌alpha-1抗胰蛋白酶(alpha墨lproteinaseinhibitor,API)、人類7疑血因子X(humanbloodcoagulationfactorX，)禾口白蛋白(Albumin,ALB)。(3)永生化人肝細胞系具有原代肝細胞的下列功能膽紅素的代謝功能、合成尿素的功能、合成凝血因子X的功能、合成白蛋白的功能。細胞與肝衰竭患者血漿進行孵育，結果培養時間的延長血漿中的膽紅素進行性降低，而血漿中的尿素濃度進行性升高，表明細胞具有很好的體外解毒功能。本發明所述永生化人肝細胞系的制備方法還包括，篩選獲得永生化人肝細胞系后，利用微載體方法大規模體外擴增永生化人肝細胞系。所述微載體可以是任何適于細胞培養的微載體。生物人工肝的制備需要的肝細胞數量非常巨大(約100-200克)，因此，采用傳統的平面培養技術很難達到這一目標。為了在體外大規模培養本發明的永生化人肝細胞系，本發明人建立了一種微載體培養永生化人人肝細胞的方法。使用的微載體可以是任何適合細胞培養的微載體，包括但不限于Cytopore2和Cytodex3微載體。將微載體按照生產商的說明進行預處理后，將所述永生化人肝細胞系和微載體按照1.0xl04~1.0xl07cells/ml微載體的比例混懸于200ml培養基中，優選比例為1.0xl()S1.0xl0Scells/ml微載體。將細胞和微載體懸液加入MagnaFlex微載體懸浮培養瓶中，37°C，95%空氣5%(302，飽和濕度環境中培養。微載體培養不僅為肝細胞的生長提供了充分的貼壁空間，使培養的細胞數量在同等容器中達到平面培養的3-6倍，細胞非常容易從培養體系中裝置到生物反應器內，而且由于肝細胞在微載體貼壁生長使肝細胞在生物反應器中的存活時間明顯延長，從而提高生物人工肝的解毒功能。這些特點也使得微載體培養技術在生物人工肝領域中具有良好應用前景。本發明所要解決的第二個技術問題是所述永生化人肝細胞系在制備生物人工肝中的應用。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案本發明提供了上述方法獲得的永生化人肝細胞系在制備生物人工肝中的應用。尤其是將微載體培養的永生化人肝細胞系作為肝細胞材料，裝載到中空纖維濾器的管外空間中，制備成一種生物反應器。這種生物反應器通過與透析治療儀相連接，就制備成一種混合型人工肝支持系統，該系統可以應用于肝功能衰竭病人的治療。本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種永生化人肝細胞系在制備治療肝功能衰竭藥物中的應用。試驗表明，本發明所述的永生化人肝細胞系，尤其是采用微載體培養的永生化人肝細胞對急性肝功能衰竭的動物進行腹腔透析，可以使動物的生存率由0%提高到80%,進一步表明永生化人肝細胞系具有體內解毒功能。綜合上述，本發明所述的永生化人肝細胞系的優勢在于1.細胞保留了原代人肝細胞的主要特性，例如表達肝細胞的功能性分子，包括代謝膽紅素的膽紅素二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶(bilirubin-uridinediphosphate-glucuronosyltransferase，UGT)，代謝氨的谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)，解毒和生物轉化功能的谷胱甘肽轉移酶兀(glutathione-S-transferase兀，GST);細胞合成并分泌alpha-l抗胰蛋白酶(alpha-1proteinaseinhibitor,API)、人類凝血因子X(humanbloodcoagulationfactorX，)和白蛋白(Albumin,ALB)。2.細胞保留了原代人肝細胞的主要功能，例如膽紅素的代謝功能、合成尿素的功能、合成凝血因子X的功能、合成白蛋白的功能。3.細胞可以在體外進行無限制的體外擴增培養。4.本發明的永生化肝細胞是人源化的，無種屬差異，用于生物人工肝治療時，避免了異種蛋白的免疫反應，從根本上解決了現有豬肝細胞作為生物人工肝活性細胞的動物源性感染問題。5.將本發明永生化人肝細胞系聯合微載體培養技術，可以用于制備生物人工肝支持系統，可以用于制備治療肝功能衰竭的藥物，應用于肝功能衰竭病人的治療。下面結合附圖和具體實施方式進一步說明本發明，但是應當指出，附圖和實施例僅作為說明本發明的例子，不限制本發明的范圍。圖1:所用載體框架所用的載體包括三個質粒pWPT-GFP基因轉移載體，含有由CMV啟動子啟動的增強型GFP基因(EGFP);病毒包裝載體psPAX2，編碼HIV-1的Gag和Pol前體，以及調節蛋白Tat和Rev;衣殼編碼質粒pMD.G,表達病毒的VSVG包裝蛋白。圖2.永生化人肝細胞系的形態；A.永生化人肝細胞系的形態B.永生化人肝細胞系的生長曲線圖3.IHH的功能特性分析；A:RT-PCR檢測IHH細胞肝臟特異基因的mRNA表達，泳道1-14依次為1:DL-2000DNA標記；2:猴病毒40大T抗原；3:人端粒酶逆轉錄酶；4:al-抗胰蛋白酶；5:細胞角蛋白18;6:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶；7:谷胺酰胺合成酶；8:谷胱甘肽硫轉移酶；9:人凝血因子X;10:卩-actin;11:白蛋白；12:ASGPI;13:CYP;14:DL-2000DNA標記;B:蛋白質印跡法檢測IHH上肝細胞特異性功能蛋白的表達，泳道1-6分別為1:al-抗胰蛋白酶；2:谷胺酰胺合成酶；3:谷胱甘肽硫轉移酶；4:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶；5:白蛋白6:actin;圖4:Gimsa染色觀察微載體培養的IHH，A:中空微載體上培養的IHH;B:實體微載體培養的IHH;圖5:IHH對肝功能衰竭患者血漿的解毒作用；A為對肝功能衰竭患者血漿總膽紅素的影響，B為對肝功能衰竭患者血漿尿素氮濃度的影響；其中LSEC為人肝竇內皮細胞，作為陰性對照；HFHC為人胚胎肝細胞，作為陽性對照；IHH為本發明的永生化人肝細胞系；TB指總膽紅素，BUN指尿素氮；圖6:微載體培養IHH制備的生物人工肝對肝功能衰竭患者血漿的解毒作用；A為對肝功能衰竭患者血漿總膽紅素的影響，B為對肝功能衰竭患者血漿尿素氮濃度的影響；其中TB指總膽紅素，BUN指尿素氮。具體實施例方式實施例1永生化人肝細胞系(IHH)的建立原代分離的人肝細胞的獲得通過膠原酶灌注法從肝切除的外科手術標本分離肝細胞(NguyenTH,OberholzerJ，BirrauxJ,etal.HighlyefficientLentiviralvector-mediatedtransductionofnondividing,frillyreimplantableprimaryhepatocytes.Moleculartherapy,2002,6(2):199-209)。載體和質粒如圖1所示，所用的載體包括三個質粒pWPT-GFP基因轉移載體，含有由CMV啟動子啟動的增強型GFP基因(EGFP);病毒包裝質粒psPAX2，編碼HIV-1的Gag和Pol前體，以及調節蛋白Tat和Rev;衣殼編碼質粒pMD.G，表達病毒的包裝蛋白VSVG。攜帶SV40T抗原基因的質粒Plox-Ttag-iresTK和攜帶hTERT基因的質粒9pBabe-hygro-hTert。(載體質粒均購自瑞士Addgene機構)。構建編碼SV40T抗原和hTERT的慢病毒載體將慢病毒載體質粒pWPT-GFP用NEB公司的BamHl和SalI酶進行雙酶切釋放出GFP，酶切條件為50(il反應體系中BamHl和SalI的量分別加1^1，37°Clh，15min，然后65t)20min使酶滅活；然后將載體兩端抹平，方法是在上述反應結束后向反應體系加入1^1Klenow酶和2mMdNTP，室溫放置15min，75°C，25min，最后再加入0.25nlcip酶于37。C孵育30min。最后將酶切產物進行l。/。低融點瓊脂糖凝膠電泳，用德國Qiagen公司凝膠回收試劑盒(貨號28704)回收載體pWPT片段。將質粒Plox-Ttag-iresTK和質粒Plox-TERT-iresTK用SalI和EcoRI進行雙酶切，酶切條件為37°C30min，65°C20min使酶滅活；然后將兩端抹平，方法是在上述反應結束后向反應體系加入1^1Klenow酶和2mMdNTP，室溫放置15min,75°C，25min，最后再加入0.25(ilcip酶于37""C孵育30min。最后將酶切產物進行1%低融點瓊脂糖凝膠電泳，用德國Qiagen公司凝膠回收試劑盒(貨號28704)分別回收SV40T抗原片段和hTERT片段。將這兩個片段測序后進行基因序列比對證實SV40T抗原片段與GenebankNo.J02400的nt2691-5163序列相同；而hTERT片段與GenebankNo.AF018167序列相同。隨后將得到的目的基因片段(SV40T抗原片段和hTERT片段)分別與回收的載體片段連接，連接反應條件為使用T4連接酶，16'C過夜。如此得到分別編碼SV40T抗原和hTERT基因的pWPT-SV40Tag載體和pWPT-hTERT載體。慢病毒顆粒的包裝將293T細胞培養在含10%FCS、100ug/ml青/鏈霉素的DMEM中，轉染前24h將其以3x106細胞/皿接種在100mm的培養皿中。轉染前2h更換新鮮培養基。每個培養皿轉染20ug質粒DNA，其中包括10ug轉染載體質粒(pWPT-GFP或pWPT-SV40Tag或pWPT-hTERT)，3.5ug衣殼編碼質粒和6.5ug包裝質粒。將此20ug質粒載體用0.1xTE溶液(lmMTris-HCl和0.1mMEDTA)重懸至體積450(al,再加入50)al的2.5MCaC12溶液，輕輕混勻。然后一邊渦旋混勻一邊逐滴加入500(al的2xHEPES緩沖鹽溶液(0.1MHEPES,0.281MNaCl,禾卩1.5mMNa2HP04[pH7.12])。室溫放置30min，然后將混合物加到培養的細胞上，慢慢加入懸液，邊加邊輕輕震動皿中的培養基。然后將培養皿放入37'C培養箱培養。16h后更換10ml新鮮培養基。以后每隔24h收集并更換一次培養基，收集的上清通過900g離心10min以去除細胞碎片，用0.2卞m孔徑的針頭濾器過濾。通過上述方法分別包裝成具有感染能力但復制缺陷的帶有GFP基因、SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因的慢病毒顆粒，然后直接使用或凍存在-8(TC備用。病毒顆粒的滴定在12孔板中接種Hela細胞，密度為1x105細胞/L，培養在添加10%FCS,2mM谷氨酰胺，禾BlOmMHepes(GibcoBRL,LifeTechnologies)的DMEM培養基中。在37°C、5%C02培養箱中培養過夜。加入連續稀釋的慢病毒顆粒和終濃度8pl/ml凝聚胺，繼續培養48h。用胰酶消化收集細胞，離心后棄上清，將沉淀重懸在300pl3.7M甲醛/PBS中，用FACS分析EGFP陽性細胞比例。滴度表示為轉導單位/ml(TU/ml)，TUs(transductionunits)。本實驗測得的病毒顆粒滴度為2x107TU/ml。細胞數xEGFP陽性細胞比例x稀釋度滴度=病毒顆粒體積(ml)x100慢病毒顆粒感染人肝細胞原代分離的人肝細胞接種于24孔板中，使用DMEM/F-12培養基(GIBCO-BRL)，其中添加10。/。FCS,1xlO-6M地塞米松，lxl0'8M三碘甲腺原氨酸，lxl0-8M牛胰島素，5ug/ml轉鐵蛋白，15mMHepes和100ug/ml肝細胞生長因子。培養24h后用PBS洗一次，然后加入含3xl06TU的帶有SV40T抗原基因的病毒顆粒50(^1，相當于感染復數(multiplicityofinfection,moi)30。然后放入37。C培養箱中，培養16h后更換新鮮培養基。7天后用同樣方法感染帶有hTERT基因的病毒顆粒。感染后陽性克隆的篩選由于正常人肝細胞體外不增殖，只有感染成功的細胞表現出增殖現象，并在局部形成細胞克隆。因此，感染后選擇增殖的肝細胞克隆，用彎頭吸水管吸取一滴消化液(0.ln/。胰酶/0.1。/。EDTA溶液)，在倒置相差顯微鏡觀察下，將吸管尖端置于增殖的細胞克隆上，輕輕擠出消化液并保持吸管位置不變，待該克隆細胞收縮變圓后立即吸起該克隆的細胞，用IHH培養基重懸后分別接種96孔板和24孔板各一孔。所述的IHH培養基為DMEM/F-12培養基(GIBCO-BRL)，其中添加10%FCS,15mMHepes和100ug/ml肝細胞生長因子。將96孔板的細胞用于篩選鑒定，24孔板的細胞用于擴增培養。由于alpha-l抗胰蛋白酶(Api)是肝細胞的特異性標志物，因此Api陽性的細胞克隆將是我們所需要的肝細胞克隆。具體地，待96孔板內細胞生長至80%匯合，將其用PBS洗滌2次，然后用4%多聚甲醛于室溫固定30min。PBS洗滌3次后，加入1%BSA7PBS溶液室溫封閉15min，然后加入小鼠抗人Api抗體(美國，Sigma公司)4°C過夜。經PBS洗滌3次后，加入FITC標記的羊抗小鼠IgG，室溫孵育30min，PBS洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察并記錄Api陽性的細胞克隆。選擇和Api陽性細胞克隆對應的24孔板中的細胞用IHH培養基連續傳代培養，傳代超過80代，獲得了該永生化人肝細胞系(Immortalhumanhepatocytecellline,IHH)，該細胞系呈單層貼壁生長(如圖2A)，經MTT分析測定細胞的生長曲線(如圖2B)發現其體外增殖迅速。該永生化人肝細胞系IHH已于2009年8月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo.3210。保藏地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。實施例2IHH的功能特性評價實施例1所獲得的永生化人肝細胞系的功能特性，首先應用RT-PCR方法檢測了IHH表達成人肝細胞特異分子mRNA的情況。收集IHH細胞，使用Qiagen公司的RNA提取試劑盒進行總RNA的提取，隨后取2ug總RNA，使用Qiagen公司的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。然后使用Promega公司的Taq酶進行PCR擴增，其中所使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成，各基因的特異引物序列如下表1:表l.PCR擴增引物序列基因上游引物下游引物產物SV40Tag5'-caggcatagagtgtctgc-3'5'-caacagcctgttggcatatg-3'422bphTERT5'-cctcaggcgacaaggagcag-3'5'-agcgggcagtgcgttcttgag-3,244bpAPI5'-caatatcttcttctcccc-3'5'-atgcctaaacgcttcatc3'534bpCK-18-tgctgctgatgactttagag-3'5'-agcctcgatctctgtctcc-3'141bpUGT1-tctgctatgcttttgtctgg-3'5'-ggatagtggattttggtgaa-3'504bpGS5'-atgctggagtcaagattgcg-3.5'-tcattgagaagacacgtgcg-3'535bpGST-gccctacaccgtggtctatt-3'5'-ggctaggacctcatggatca-3'496bpHBCF-X5'-gtgcatggaagagacctgct-3'5'-gaagtcaagcaggtcgaagg-3'493bpALB-aaacctcttgtggaagagcc-3'5'-caaagcaggtctccttatcg-3'596bp(3-actin5-tggcaccacaccttctacaatgagc-3'5-gcacagcttctccttaatgtcacgc-3'396bp擴增條件為初始變性溫度94°C2min，循環變性溫度94°C30s，退火溫度55°C30s,延伸溫度72。C30s，共30個循環。終末延伸溫度72。C10min，4。C冷卻。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，在Alphalmager2200型凝膠成像系統上進行分析。結果發現IHH表達肝細胞特異的基因Api和CK-18的mRNA，表達參與膽紅素代12謝的酶UGT1的mRNA、參與氨代謝的酶GS和氧化還原反應的II相酶GST的mRNA，也表達凝血因子HBCF-X和ALB的mRNA(圖3A)。隨后應用Westernblot檢測了肝細胞功能蛋白al-抗胰蛋白酶(Api)尿苷二磷酸膽紅素葡萄糖醛酸轉移酶l(UGT1)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和白蛋白(ALB)的表達。結果證實在蛋白質水平IHH也表達這幾種蛋白(圖3B)。實施例3IHH的安全性評價取對數生長期的實施例1獲得的IHH細胞，用Hank's液(137.93mMNaCl,5.33mMKC1,4.17mMNaHC03，1.26mMCaC12,0.493mMMgC12,0.441mMKH2P04,0.338mMNa2HP04,5.56mMD-葡萄糖)洗滌2次后重懸于DMEM/F12基礎培養基中，將細胞接種于5只BALB/c裸鼠皮下和肝臟，每個點接種5"06個細胞。另一組裸鼠同時于皮下及肝臟相同部位接種肝癌細胞BEL-7402作為陽性對照，每個點接種5><106個細胞作為陽性對照。接種后連續觀察6個月，結果在裸鼠的皮下和肝臟接種點均無腫瘤形成，而在相同部位接種同樣數量肝癌細胞BEL-7402的裸鼠皮下和肝臟在移植1個月后即均有腫瘤形成。實施例4.微載體培養永生化人肝細胞系分別取5g微載體Cytopore2(空心微載體)或Cytodex3(實心微載體)，置入300ml無Ca"和Mg"的PBS液中，力口l-2mlTween-80，震蕩混勻，水化過夜，離心，去除上清液，用新的無C和Mg^的PBS液300-500ml沖洗幾分鐘，重復3次，最后再加入無Ca2+和Mg"的PBS液至300ml，在115。C，15psi條件下高壓滅菌15min，迅速冷卻，加入300mlDMEM培養基，30min后棄去上清，重新加入300ml含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基，放置過夜后使用。將實施例1獲得的IHH細胞和微載體以5.0xl05cells/ml微載體的比例混合，接種于未處理的培養瓶中，使用的培養基為DMEM/F-12培養基(GIBCO-BRL)，其中添加10%FCS,15mMHepes和100ug/ml肝細胞生長因子。將培養瓶置于含有5%C02、95%空氣、飽和濕度的37i:培養箱培養。為利于細胞貼附在微載體上，使用滾動培養。每隔24h換液一次。微載體上的肝細胞形態和數量通過Gimsa染色進行觀察，當微載體上長滿細胞時，Gimsa染色可見微載體上均勻分布的著色的細胞核(圖4)。實施例5IHH對肝衰竭患者血漿的體外解毒功能評價為分析實施例1獲得的IHH對肝衰竭患者血漿的解毒能力，將IHH(1><105細胞)分別接種于24孔培養板，同時，以1"05細胞/孔的細胞密度接種永生化人肝竇內皮細胞系(humanliversinusoidalendothelialcells,LSEC)作為陰性對照，以人胚胎肝細胞作為陽性對照。培養2天后將培養基換成含有50。/。肝衰竭患者血清的培養基，每孔lml，每個血清樣本設三個平行孔。分別于培養12、24、48小時收集各培養孔的上清200pl，凍存于-8(TC冰箱待測。待樣品全部收集結束后，應用OLYMPUSAU400型生化檢測儀，分別測定培養上清中總膽紅素和尿素的水平。結果如圖5，實施例l獲得的永生化人肝細胞系IHH能有效降低肝衰竭患者血漿中的膽紅素，增加血漿中尿素濃度，并表現明顯的時間依賴性。實施例6IHH對肝衰竭實驗動物的體內解毒功能評價采用腹腔注射四氯化碳的方法用裸鼠制備急性肝功能衰竭的動物模型，并將模型動物分為三組(每組14只)。第一組在四氯化碳注射后24小時腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2ml，第二組在西氯化碳注射后24小時腹腔注射2ml沒有肝細胞的微載體，第三組在四氯化碳注射后24小時注射2ml長滿永生化人肝細胞的微載體(按照實施例4所述的方法培養，達到6"06細胞)，比較各組動物的生存率。結果顯示第一組動物在四氯化碳注射3天后動物生存率為0%;第二組動物在四氯化碳注射4天后生存率為0%;而第三組動物在四氯化碳注射3天后生存率為80%，并持續2周沒有變化。結果表明，釆用微載體培養的永生化人肝細胞對急性肝功能衰竭的動物進行腹腔透析，可以使動物的生存率由0%提高到80%，進一步表明實施例1獲得的永生化人肝細胞系具有體內解毒功能。實施例7:永生化人肝細胞系作為細胞材料在生物人工肝制備中的應用按照實施例4所述方法使用微載體大量擴增培養IHH，使用無血清培養基Keratinocyte-SFM(美國Invitrogen公司)，添加rEGF(終濃度0.1ng/ml)禾BBPE(bovinepituitaryextract)20-30ug/ml。擴增至400-500ml微載體后，將這些長滿IHH的微載體用無血清基礎DMEM/F12培養基洗滌三次，將長滿IHH的微載體裝載到中空纖維濾器的管外空間中，制備成一種生物反應器。其中中空纖維濾器可以是任何適用于制備生物反應器的中空纖維濾器，優選中空纖維管的截流分子質量30-200kDa，膜孔徑100-300nm，更優選其截流分子質量為50-150kDa，膜孔徑150-250nm。這種生物反應器通過與透析治療儀相連接，就制備成一種混合型人工肝支持系統。為檢測該系統的解毒能力，收集肝衰竭患者的置換血漿，將其用此系統進行透析12h和24h，分別檢測透析前后總膽紅素和尿素的含量。結果顯示，透析后總膽紅素進行性下降，而尿素氮水平逐漸升高(圖6)。說明該細胞既可以降低膽紅素，又具備轉化氨的能力，表明其可以作為細胞材料，用于制備生物人工肝。權利要求1、一種永生化人肝細胞系，其特征在于于2009年8月10日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.3210。2、根據權利要求l所述的永生化人肝細胞系，其特征在于所述永生化人肝細胞系的生物學特征為(1)具有體外增殖活性，細胞在體外以二倍體方式增殖；(2)表達肝細胞的功能性分子，包括代謝膽紅素的膽紅素二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶，代謝氨的谷氨酰胺合成酶，解毒和生物轉化功能的谷胱甘肽轉移酶兀，細胞合成并分泌alpha-l抗胰蛋白酶、人類凝血因子X和白蛋白；(3)具有原代肝細胞的膽紅素的代謝功能、合成尿素的功能、合成凝血因子X的功能和合成白蛋白的功能。3、權利要求1所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于通過慢病毒載體向原代分離的人正常肝細胞中轉染SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因，利用克隆法篩選獲得永生化人肝細胞系。4、根據權利要求3所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于通過慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT向原代分離的人正常肝細胞中轉染SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因，其中所述慢病毒載體pWPT-SV40Tag或pWPT-hTERT是分別將SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因插入到慢病毒載體pWPT的多克隆位點得到的重組載體。5、根據權利要求4所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于所述慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT按照如下方法將SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因導入到人正常肝細胞中分別構建含有SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因的慢病毒載體pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT;然后包裝成具有感染能力但復制缺陷的帶有SV40T抗原或人端粒酶催化亞單位基因的慢病毒顆粒；再感染人正常肝細胞。6、根據權利要求3、4或5所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于所述人正常肝細胞為人成體肝細胞。7、根據權利要求3或4所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于還包括篩選獲得所述永生化人肝細胞系后，將該永生化人肝細胞系體外在微載體上擴大培養。8、根據權利要求7所述的永生化人肝細胞系的制備方法，其特征在于所述永生化人肝細胞系和微載體按照1.0xl04~1.0xl07cells/ml微載體的比例混懸于培養基中，進行擴大培養。9、權利要求18任一權利要求所述的永生化人肝細胞系在制備生物人工肝中的應用。10、權利要求18任一權利要求所述的永生化人肝細胞系在制備治療肝功能衰竭藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種永生化人肝細胞系及其制備方法和用途。本發明所提供的永生化人肝細胞系具有原代人肝細胞的主要功能，是通過慢病毒載體向原代分離的人正常肝細胞中轉染SV40T抗原和人端粒酶催化亞單位基因，利用克隆法篩選獲得永生化人肝細胞系。該永生化人肝細胞系還可以利用微載體方法大規模體外擴增。本發明所述的永生化人肝細胞系可以用于制備生物人工肝支持系統，可以應用于制備治療肝功能衰竭的藥物。文檔編號C12N5/10GK101659941SQ20091009134公開日2010年3月3日申請日期2009年8月18日優先權日2009年8月18日發明者婁晉寧申請人:中日友好醫院