仿肝板結構肝細胞三維培養裝置及其培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種仿肝板結構肝細胞三維培養裝置，包括微流控芯片；微流控芯片內開設依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，第一主通道遠離第二主通道的一端同時直線延伸形成一分支通道；分支通道的末端均設置與相應分支通道導通的導料管，導料管內開設有導通孔且導料管垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入形成肝板結構所需的原料。本發明還公開一種利用上述裝置的仿肝板結構肝細胞三維培養方法。通過上述方式，以便在體外實現肝細胞在體內肝臟中肝板結構一樣的三維生長環境。
【專利說明】仿肝板結構肝細胞三維培養裝置及其培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及肝臟組織工程和生物人工肝領域，特別是涉及一種仿肝板結構肝細胞
三維培養裝置及其培養方法。
【背景技術】
[0002]目前，治療各種終末期肝臟疾病的有效手段依然是肝移植，但供體肝來源的嚴重缺乏和移植排斥等問題限制肝移植的廣泛應用。因此，以實現肝臟功能修復、替代及重建為目標的生物人工肝和肝臟組織工程成為肝衰竭治療的新方向。
[0003]生物人工肝和肝臟組織工程所共性的難題之一是如何在體外模擬肝細胞在體的三維培養微環境。目前生物人工肝有中空纖維型、多層平板型、填充床式及包裹懸浮型等三維培養模式；肝臟組織工程有借助于快速成型技術的生物支架材料、細胞片層及去細胞化肝臟再灌注細胞等三維培養模式。
[0004]盡管現有肝細胞三 維培養模式較多，但大部分培養模式都只是實現肝細胞在三維生長環境下培養，并未真正再現肝細胞在體內狀態下的培養，而且肝細胞的功能狀態也與體內肝細胞相差甚遠。
[0005]體內肝細胞處于一種三維環境中，細胞間相互作用有助于調節細胞的生長和功能分化，某種意義上說，肝臟本身就是一個極佳的肝細胞培養器，其內肝細胞不僅達到數量和密度上的要求，還呈現有序極性排列。肝細胞處于三維環境具體表現為:肝細胞與其周圍的肝血竇內皮細胞、肝星狀細胞、Kupffer細胞及細胞外基質等相互作用；肝臟內血管和膽道系統為肝細胞提供氧氣和營養物質，同時帶走肝細胞的代謝廢物。而肝臟的基本結構功能單位為肝小葉，肝小葉又由肝板間隔肝血竇構成。
[0006]如何構建體外肝細胞培養的三維環境，是目前生物人工肝和肝臟組織工程亟待解決的問題之一。

【發明內容】

[0007]本發明主要解決的技術問題是提供一種仿肝板結構肝細胞三維培養裝置及其培養方法，以便在體外實現肝細胞在體內肝臟中肝板結構一樣的生長環境。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:提供一種仿肝板結構肝細胞三維培養裝置，包括微流控芯片；所述微流控芯片內開設依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，所述第一主通道遠離第二主通道的一端同時直線延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均設置與相應分支通道導通的導料管，導料管內開設有導通孔且導料管垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入形成肝板結構所需的原料。
[0009]其中，所述芯片為聚二甲硅氧烷微流控芯片。
[0010]其中，所述主通道和分支通道的深度均為160 μ m。[0011]其中，所述第一主通道的長、寬為300 μ m、100 μ m ;所述第二主通道的長、寬為300 μ m、200 μ m ;所述第三主通道的長、寬為50mm、400 μ m。
[0012]其中，所述第一主通道遠離第二主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為60° ;所述第一主通道與第二主通道連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為120° ;所述第二主通道與第三主通道連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為180。。
[0013]其中，所述每個分支通道的寬度均為100 μ m;所述第一主通道遠離第二主通道的一端直線延伸形成的分支通道的長度為300 μ m ;所述第一主通道遠離第二主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道，其與第一主通道相接的一邊長均為560 μ m,與第一主通道直線延伸的分支通道相接的一邊長均為416 μ m ;所述第一主通道與第二主通道的連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的邊長為693 μ m ;所述第二主通道與第三主通道的連接處對稱延伸形成的兩個分 支通道，其與第二主通道相接的一邊長均為500 μ m,與第三主通道相接的一邊長均為400 μ m。
[0014]其中，導料管的高度為2420 μ m，其導通孔的直徑為100 μ m。
[0015]為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:提供一種仿肝板結構肝細胞三維培養方法，包括步驟:將含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液分別加入仿肝板結構肝細胞三維培養裝置；將仿肝板結構肝細胞三維培養裝置形成的包裹有肝板結構的水凝膠導出裝置，并置于培養基中進行培養；培養完成后，降解水凝膠，獲得肝板組織；仿肝板結構肝細胞三維培養裝置包括微流控芯片；微流控芯片內開設依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，第一主通道遠離第二主通道的一端同時直線延伸形成一分支通道；分支通道的末端均設置與相應分支通道導通的導料管，導料管內開設有導通孔且導料管垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液。
[0016]其中，將含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液分別加入仿肝板結構肝細胞三維培養裝置的步驟包括:通過第一主通道與第二主通道連接處的兩個分支通道末端的導料管分別通入緩沖液；通過第一主通道一端直線延伸形成的分支通道末端的導料管通入含肝細胞的海藻酸鈉溶液，同時，通過第一主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道末端的導料管分別通入含內皮細胞的海藻酸鈉溶液；通過第二主通道與第三主通道連接處的兩個分支通道末端的導料管分別通入膠凝液。
[0017]其中，緩沖液包括10% (w/v)葡聚糖、0.9% (w/v)NaCl 及 lOmmol/LHEAPS ;含肝細胞的海藻酸鈉溶液包括0.7% (w/v)海藻酸鈉、0.9% (w/v) NaCl>0.05% (w/v)去端肽膠原、1% (w/v)牛血清白蛋白、lOmmol/LHEAPS及3X IO7個/ml肝細胞；含內皮細胞的海藻酸鈉溶液包括0.7% (w/v)海藻酸鈉、0.9% (w/v) NaCl>0.05% (w/v)去端肽膠原、1% (w/v)牛血清白蛋白、lOmmol/L HEAPS及I X IO7個/ml內皮細胞；膠凝液包括10% (w/v)葡聚糖、20mmol/L BaCl2、0.72% (w/v) NaCl 及 10mmol/L HEAPS。
[0018]其中，緩沖液、含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液及膠凝液的通入速度依次為 1-9 μ 1/min、15-25 μ 1/min,5-15 μ 1/min 及 95-105 μ 1/min。[0019]其中，降解水凝膠，獲得肝板組織的步驟具體為，利用含lU/ml藻酸鹽裂解酶的PBS磷酸鹽緩沖液降解水凝膠，以獲得包裹在其內的肝板組織。
[0020]本發明的有益效果是:區別于現有技術的情況，本發明仿肝板結構肝細胞三維培養裝置包括依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道，且第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，同時，第一主通道遠離第二主通道的一端還直線延伸形成一分支通道。每一分支通道的末端都有一導料管用于通入形成肝板結構所需的原料，如:含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液。通過加入上述原料，仿肝板結構肝細胞三維培養裝置可形成包裹有肝板結構的水凝膠，對包裹有肝板結構的水凝膠進行培養，培養完成后，降解水凝膠，獲得肝板組織，從而在體外實現肝細胞在體內肝臟中肝板結構一樣的三維生長環境，促進了肝細胞功能的發揮及肝細胞形態活力的維持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發明仿肝板結構肝細胞三維培養裝置一實施例的結構透視圖；
[0022]圖2是圖1所示裝置與管體連接的結構透視圖；
[0023]圖3是圖1所示裝置形成的包裹有肝板結構的水凝膠的示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明。
[0025]實施例1
[0026]請參閱圖1，圖1是本實施例仿肝板結構肝細胞三維培養裝置的結構透視圖，如圖1所示，本實施例的裝置為內部設有通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片。
[0027]通道包括主通道和與主通道相通的分支通道，主通道包括依次直線連接且相通的第一主通道11、第二主通道12和第三主通道13。
[0028]第一主通道11遠離第二主通道12的一端、第一主通道11與第二主通道12的連接處及第二主通道12與第三主通道13的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道。具體為，第一主通道11遠離第二主通道12的一端的上下兩側對稱延伸形成第一分支通道21和第二分支通道22 ;第一主通道11與第二主通道12的連接處的上下兩側對稱延伸形成第三分支通道23和第四分支通道24 ;第二主通道12與第三主通道13的連接處的上下兩側對稱延伸形成第五分支通道25和第六分支通道26 ;同時，第一主通道11遠離第二主通道12的一端還直線延伸形成第七分支通道27。
[0029]在本實施例中，第一分支通道21、第二分支通道22、第三分支通道23、第四分支通道24、第五分支通道25、第六分支通道26及第七分支通道27的末端均設置與相應分支通道導通的導料管31，導料管31內開設有導通孔，且導料管31垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入形成肝板結構所需的原料。
[0030]在本實施例中，仿肝板結構肝細胞三維培養裝置采用軟光刻和再鑄模技術制作而成，該裝置在仿肝板結構肝細胞培養前，需進行高壓滅菌、消毒烤干的處理。
[0031]在本實施例中，主通道和分支 通道的尺寸如下:[0032]主通道和分支通道的深度均為160 μ m,且分支通道的寬度均為100 μ m。
[0033]第一主通道11的長、寬為300μπι、100μπι ;第二主通道12的長、寬為300 μ m、200 μ m ;第三主通道13的長、寬為50mm、400ym。
[0034]第一分支通道21和第二分支通道22的夾角為60° ;第三分支通道23和第四分支通道24的夾角為120° ;第五分支通道25和第六分支通道26的夾角為180°。
[0035]第七分支通道27的長度為300 μ m ;第一分支通道21或第二分支通道22與第一主通道11相接的一邊長為560 μ m,與第七分支通道27相接的一邊長為416 μ m ;第三分支通道23或第四分支通道24的長度為693 μ m ;第五分支通道25或第六分支通道26與第二主通道12相接的一邊長為500 μ m,與第三主通道13相接的一邊長為400 μ m。
[0036]導料管31的高度為2420 μ m,其導通孔的直徑為100 μ m。將直徑為100 μ m的聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene, PTFE)超細管或其他符合直徑要求的管子插入導料管31，以使液體由導通孔進入相應的通道，從而形成如圖2所示的結構。[0037]在本實施例中，所述微流控芯片的長、寬、高為6cm、3cm、5mm。通道位于芯片的中央，第三主通道13距芯片上下兩個側邊的距離均為14800 μ m。每個通道的底部至相應導料管31頂部之間的高度為2580 μ m，通道底部距芯片底部的距離為2420 μ m。
[0038]肝小葉是肝臟的基本功能單位，肝小葉可以看作是一個微型化的肝臟，而肝小葉又由肝板間隔肝血竇構成，因此，本實施例仿肝板結構肝細胞三維培養裝置在體外構建仿生理結構的肝細胞三維培養環境具有極其重要的意義。
[0039]下面詳細闡述利用本實施例的仿肝板結構肝細胞三維培養裝置進行仿肝板結構肝細胞三維培養的方法。
[0040]本實施例需使用的器材包括:細胞消化用器材、微量注射泵、注射器、培養皿和玻璃棒，上述器材使用前均在超凈臺內由紫外照射消毒。
[0041]仿肝板結構肝細胞三維培養方法具體如下:
[0042]A.制備包裹有肝板結構的水凝膠
[0043]a.制備緩沖液、海藻酸鈉溶液及膠凝液
[0044]緩沖液包括10% (w/v)葡聚糖、0.9% (w/v) NaCl及lOmmol/LHEAPS ;海藻酸鈉溶液包括0.7% (w/v)海藻酸鈉、0.9% (w/v) NaCl>0.05% (w/v)去端肽膠原、1% (w/v)牛血清白蛋白及 10mmol/L HEAPS ;膠凝液包括 10% (w/v)葡聚糖、20mmol/L BaCl2、0.72% (w/v)NaCl及lOmmol/L HEAPS。將制備好的溶液放在超凈工作臺內用0.22 μ m無菌濾器除菌，然后在4°C的溫度下保存待用。
[0045]b.制備含肝細胞的海藻酸鈉溶液和含內皮細胞的海藻酸鈉溶液
[0046]本實施例使用的細胞為人肝細胞株C3A及人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926復蘇傳代培養的細胞，細胞狀態最佳，活力超過90%以上。
[0047]將制備好的緩沖液、海藻酸鈉溶液及膠凝液在室溫下放置備用。
[0048]用胰酶將培養皿中的C3A細胞和EA.hy926細胞消化下來分別移入離心管內，離心5min, 1000轉/min，棄去上清離心液，然后在兩個離心管中加入制備好的海藻酸鈉溶液，玻璃棒輕輕攪拌，使細胞均勻分散在海藻酸鈉溶液中，制成含C3A細胞的海藻酸鈉溶液和含EA.hy926細胞的海藻酸鈉溶液。其中，C3A細胞和EA.hy926細胞的濃度比為3:1。
[0049]c.在仿肝板結構肝細胞三維培養裝置中注入配置好的溶液[0050]用Iml注射器分別取Iml含C3A細胞的海藻酸鈉溶液、含EA.hy926細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液、膠凝液，在微量注射泵的作用下，將各溶液通入芯片內。其中，各溶液的注入順序依次為緩沖液、含細胞的海藻酸鈉溶液和膠凝液。緩沖液需提前注入通道，以防止過快成膠，導致通道堵塞。
[0051]各溶液在芯片的具體灌注位置為，緩沖液分別通入第三分支通道23和第四分支通道24 ;含C3A細胞的海藻酸鈉溶液通入第七分支通道27，同時含EA.hy926細胞的海藻酸鈉溶液分別通入第一分支通道21和第二分支通道22 ;膠凝液分別通入第五分支通道25和第六分支通道26。
[0052]其中，緩沖液、含C3A細胞的海藻酸鈉溶液、含EA.hy926細胞的海藻酸鈉溶液及膠凝液的通入速度分別為 5 μ l/min、20 μ 1/min、10 μ 1/min 及 100 μ 1/min。
[0053]請參閱圖3，圖3是圖1所示裝置形成的包裹有肝板結構的水凝膠的示意圖。由于C3A細胞41、EA.hy926細胞42達到穩定層流排布，細胞所處的天然細胞外基質材料海藻酸鈉溶液會與最外圍的氯化鋇鹽溶液接觸，從而發生離子交聯形成水凝膠，產生包裹有肝板結構的水凝膠。
[0054]其中，第三主通道13為成膠區。
[0055]B.將仿肝板結構肝細胞三維培養裝置形成的包裹有肝板結構的水凝膠導出裝置，并置于培養基中進行培養。
[0056]水凝膠會自動從芯片出口噴出掉入裝有培養基的培養皿內，然后對其進行培養。
[0057]C.培養完成后，降解水凝膠，獲得肝板組織。
[0058]培養約7天后，隨著肝細胞與內皮細胞連接的緊密，細胞間作用更加密切，這時可采用海藻酸鈉裂解酶浸泡水凝膠，從而降解掉水凝膠外包被，獲取完整的肝板樣組織結構。
[0059]其中，海藻酸鈉裂解酶為含lU/ml藻酸鹽裂解酶的PBS磷酸鹽緩沖液。
[0060]綜上所述，本發明的總體設計為，通過傳統軟光刻及再鑄模技術制備聚二甲硅氧烷反應芯片，在微量注射泵的作用下，將肝細胞海藻酸鈉溶液和內皮細胞海藻酸鈉溶液、緩沖液、膠凝液注入反應芯片內。由于肝細胞海藻酸鈉溶液與內皮細胞海藻酸鈉溶液在微流控技術下達到層流排布，即肝板樣排布，而且細胞所處的溶液為天然細胞外基質生物材料海藻酸鈉溶液，海藻酸鈉可通過離子交聯而形成水凝膠，從而將肝板樣結構包裹，形成的包裹肝板樣結構的水凝膠。包裹有肝板樣結構的水凝膠可直接從芯片出口自動導出，轉入培養基內培養，培養7天后，水凝膠內細胞間連接更加緊密，細胞間作用更加密切。最后將水凝膠浸泡在海藻酸鈉裂解酶中，降解水凝膠，獲取完整的肝板樣組織。
[0061]上述設計相比其他肝細胞三維培養模式，更好的模擬了肝細胞在體內狀態下的三維生長環境一肝板，且本發明裝置形成的肝板結構由海藻酸鈉水凝膠包裹，肝細胞處于天然細胞外基質海藻酸鈉水凝膠內，與內皮細胞形成極向有序共培養，極大地促進肝細胞功能的發揮及肝細胞形態活力的維持，為肝臟組織工程及生物人工肝中肝細胞三維培養環境的構建提供新的思路，同時此仿肝板組織結構也是藥物檢測的有效評價工具。
[0062]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【權利要求】
1.一種仿肝板結構肝細胞三維培養裝置，其特征在于，包括微流控芯片；所述微流控芯片內開設依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，所述第一主通道遠離第二主通道的一端同時直線延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均設置與相應分支通道導通的導料管，所述導料管內開設有導通孔且導料管垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入形成肝板結構所需的原料。
2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述芯片為聚二甲硅氧烷微流控芯片。
3.根據權利要求2所述的裝置，其特征在于，所述主通道和分支通道的深度均為160 μ m。
4.根據權利要求3所述的裝置，其特征在于，所述第一主通道的長、寬為300μ m、100 μ m ； 所述第二主通道的長、寬為300 μ m、200 μ m ； 所述第三主通道的長、寬為50mm、400ym。
5.根據權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述第一主通道遠離第二主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為60° ; 所述第一主通道與第二主通道連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為120° ； 所述第二主通道與第三主通道連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的夾角為180°。
6.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，所述每個分支通道的寬度均為ΙΟΟμπι; 所述第一主通道遠離第二主通道的一端直線延伸形成的分支通道的長度為300 μ m ; 所述第一主通道遠離第二主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道，其與第一主通道相接的一邊長均為560μπι，與第一主通道直線延伸的分支通道相接的一邊長均為416 μ m ； 所述第一主通道與第二主通道的連接處對稱延伸形成的兩個分支通道的邊長為693 μ m ； 所述第二主通道與第三主通道的連接處對稱延伸形成的兩個分支通道，其與第二主通道相接的一邊長均為500 μ m,與第三主通道相接的一邊長均為400 μ m。
7.根據權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述導料管的高度為2420μ m,其導通孔的直徑為100 μ m。
8.一種仿肝板結構肝細胞三維培養方法，其特征在于，包括以下步驟: 將含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液分別加入仿肝板結構肝細胞三維培養裝置； 將所述仿肝板結構肝細胞三維培養裝置形成的包裹有肝板結構的水凝膠導出所述裝置，并置于培養基中進行培養； 培養完成后，降解所述水凝膠，獲得肝板組織； 所述仿肝板結構肝細胞三維培養裝置包括微流控芯片；所述微流控芯片內開設依次直線連接且相通的第一主通道、第二主通道和第三主通道；所述第一主通道遠離第二主通道的一端、第一主通道與第二主通道的連接處及第二主通道與第三主通道的連接處均對稱延伸形成兩個分支通道，所述第一主通道遠離第二主通道的一端同時直線延伸形成一分支通道；所述分支通道的末端均設置與相應分支通道導通的導料管，所述導料管內開設有導通孔且導料管垂直于相應的分支通道所在面，以用于通入所述含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述將含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液、緩沖液及膠凝液分別加入仿肝板結構肝細胞三維培養裝置的步驟包括: 通過第一主通道與第二主通道連接處的兩個分支通道末端的導料管分別通入緩沖液； 通過第一主通道一端直線延伸形成的分支通道末端的導料管通入含肝細胞的海藻酸鈉溶液，同時，通過第一主通道的一端對稱延伸形成的兩個分支通道末端的導料管分別通入含內皮細胞的海藻酸鈉溶液； 通過第二主通道與第三主通道連接處的兩個分支通道末端的導料管分別通入膠凝液。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述緩沖液包括10%(w/v)葡聚糖、0.9%(w/v) NaCl 及 10mmol /T, HEAPS ； 所述含肝細胞的海藻酸鈉溶液包括0.7% (w/v)海藻酸鈉、0.9% (w/v)NaCl,0.05% (w/V)去端肽膠原、1% (w/v)牛血清白蛋白、lOmmol/LHEAPS及3X IO7個/ml肝細胞； 所述含內皮細胞的海藻酸鈉溶液包括0.7% (w/v)海藻酸鈉、0.9% (w/v) NaCU0.05%(w/v)去端肽膠原、1% (w/v)牛血清白蛋白、10mmol/L HEAPS及I X IO7個/ml內皮細胞； 所述膠凝液包括 10% (w/v)葡聚糖、20mmol/L BaCl2>0.72% (w/v) NaCl 及 10mmol/LHEAPS。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述緩沖液、含肝細胞的海藻酸鈉溶液、含內皮細胞的海藻酸鈉溶液及膠凝液的通入速度依次為1_9μ 1/π?η、15-25μ 1/min、5-15 μ 1/min 及 95-105 μ 1/min。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述降解水凝膠，獲得肝板組織的步驟具體為， 利用含lU/ml藻酸鹽裂解酶的PBS磷酸鹽緩沖液降解所述水凝膠，以獲得包裹在其內的肝板組織。
【文檔編號】C12N5/071GK103614297SQ201310593883
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】高毅, 賈志棟, 李陽 申請人:南方醫科大學珠江醫院