專利名稱：利用幼穗拯救獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用幼穗拯救獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用異源基因進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)新的良好途徑，但轉(zhuǎn)化效率低下是限制轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小麥上應(yīng)用的世界性難題。迄今為止，已報(bào)道的小麥轉(zhuǎn)基因方法主要有花粉管法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。其中，花粉管法是利用小麥花粉萌發(fā)形成的花粉管通道，將外源基因?qū)胧荏w。該項(xiàng)技術(shù)不需要愈傷組織的培養(yǎng)過程，相比于基因槍法既簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)，但因其重復(fù)性差，很難獲得分子證據(jù)，在小麥上的應(yīng)用越來越少。基因槍法是以金粉或鎢粉作為載體，通過高壓轟擊受體組織將外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中，并實(shí)現(xiàn)基因整合。但基因槍法除了需要消耗昂貴的大載體、可裂膜、阻擋網(wǎng)等一次性耗材外，插入到受體細(xì)胞中的基因往往是隨機(jī)整合，并且是多拷貝插入。因?yàn)樾←準(zhǔn)钱愒戳扼w，基因組非常龐大，多拷貝插入除了影響基因的表達(dá)效率外，轉(zhuǎn)基因后代純合較慢，難以迅速獲得純合株系。另夕卜，篩選標(biāo)記難以去除也是限制基因槍轉(zhuǎn)化小麥的主要因素之一。農(nóng)桿菌法則克服了上述兩種方法的缺點(diǎn)，其原理是先用目標(biāo)基因替換根癌農(nóng)桿菌上的致癌基因，在農(nóng)桿菌侵染受體材料時(shí)，目標(biāo)基因被釋放整合進(jìn)入受體細(xì)胞，這種插入往往以單拷貝或低拷貝的形式發(fā)生，而且作為質(zhì)粒復(fù)制所需要的篩選標(biāo)記被留在受體細(xì)胞外，提高了轉(zhuǎn)基因的安全性。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的上述優(yōu)點(diǎn)，賦予它具有極大的應(yīng)用潛力。但是農(nóng)桿菌的天然寄主是雙子葉植物，對(duì)許多單子葉植物侵染困難。近年來，通過科學(xué)家的不斷努力，水稻、玉米、小麥等重要的單子葉植物的轉(zhuǎn)化相繼成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈傷組織為受體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，其效率已經(jīng)達(dá)到90%。而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥效率低下仍然是一世界性難題。目前，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法主要有兩種:一是農(nóng)桿菌侵染幼胚、成熟胚及其誘導(dǎo)形成的愈傷組織，通過后續(xù)的愈傷誘導(dǎo)、篩選和再生獲得轉(zhuǎn)基因小麥，但農(nóng)桿菌侵染后的愈傷組織，往往因?yàn)檗r(nóng)桿菌的毒性而褐變，無法繼續(xù)生長(zhǎng)，造成轉(zhuǎn)化效率低下。二是莖尖分生組織侵染法，即利用農(nóng)桿菌侵染創(chuàng)傷的莖尖分生組織，不經(jīng)過愈傷組織的篩選過程，直接收獲種子，然后對(duì)獲得的后代進(jìn)行篩選和鑒定。在這個(gè)轉(zhuǎn)化過程中，因?yàn)榍o尖是一個(gè)高度分化的器官，其中只有部分細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，因此，轉(zhuǎn)化體為轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞共存的嵌合體，而且轉(zhuǎn)化細(xì)胞最終發(fā)育成為可遺傳器官的幾率微乎其微。因此，單純的莖尖轉(zhuǎn)化法在轉(zhuǎn)化當(dāng)代(Ttl代)檢測(cè)的陽(yáng)性比率高達(dá)75 %，但是在T1代中的比率極少。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是 提供一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞的步驟，所述方法包括如下步驟:
I)將含有目的DNA表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌接種于胚芽鞘長(zhǎng)為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養(yǎng)所述露白小麥種子獲得處于雌雄蕊分化期的幼穗；
2)取步驟I)得到的處于雌雄蕊分化期的幼穗進(jìn)行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉(zhuǎn)基因小麥。
在上述方法中，步驟I)中所述接種是在所述胚芽鞘長(zhǎng)為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中注入I U L所述含有目的DNA表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌菌液。
在上述方法中，所述重組農(nóng)桿菌菌液的0D_為0.6。
在上述方法中，所述重組農(nóng)桿菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L0
在上述方法中，所述農(nóng)桿菌可為根癌農(nóng)桿菌，具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述處于雌雄蕊分化期的幼穗接種于脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得愈傷組織。
在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織后，還包括將所述含有所述目的DNA的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得具有根莖葉的小麥植株的步驟。
在上述方法中，所述脫分化培養(yǎng)基和所述分化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
在上述方法中，所述脫分 化培養(yǎng)基中含2.5mg/L 2，4_D和/或150mg/L特美汀和/或篩選轉(zhuǎn)化體的抗生素，PH值為5.8 ;所述分化培養(yǎng)基中含2mg/L KT和/或篩選轉(zhuǎn)化體的抗生素，pH值為5.8。
在上述方法中，所述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的光照條件為:連續(xù)光照，所述連續(xù)光照的光照強(qiáng)度為1500LUX。
本發(fā)明將幼穗拯救法與萌發(fā)種子轉(zhuǎn)化法相結(jié)合獲得轉(zhuǎn)基因小麥，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到12%。本發(fā)明的方法既克服了一般莖尖轉(zhuǎn)化法形成嵌合體的問題，又解決了農(nóng)桿菌直接侵染小麥幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的組織褐化死亡問題，對(duì)小麥品種的遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新具有十分重要的意義。


圖1為農(nóng)桿菌侵染所用的小麥露白種子。
圖2為共培養(yǎng)三天后種子的萌發(fā)生長(zhǎng)情況。
圖3為轉(zhuǎn)化后Gus基因在Ttl代轉(zhuǎn)化植株中的嵌合表達(dá)。
圖4為轉(zhuǎn)化后Gus基因在Ttl代轉(zhuǎn)化植株根部的表達(dá)。
圖5為幼穗拯救適宜的小麥幼穗大小。
圖6為幼穗拯救過程中愈傷組織的切塊培養(yǎng)。
圖7為用于分化再生的胚性愈傷組織。
圖8為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。其中，I為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，從上到下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;2_16 為部分 Ttl 代轉(zhuǎn)基因植株；17 為質(zhì)粒PCAMBIA2301 (陽(yáng)性對(duì)照);18為非轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照)。
圖9為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株中Gus基因在根部的表達(dá)情況。其中，左側(cè)的2個(gè)為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照，右側(cè)的2個(gè)為Ttl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
圖10為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株中Gus基因在葉子中的表達(dá)情況。左側(cè)的2個(gè)為Ttl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，右側(cè)的2個(gè)為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。
圖11為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株中Gus基因在籽粒中的表達(dá)情況。左側(cè)的2個(gè)為Ttl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，右側(cè)的I個(gè)為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒pCAMBIA2301 (GenBank AF234316，其部分序列見序列表序列3)和根癌農(nóng)桿菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens)均購(gòu)自中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心。質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)基因小麥基因組DNA的提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，培養(yǎng)基配制所需的無機(jī)鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，維生素、抗生素、激素以及Gus染色所需的藥品均購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)公司。
用于進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的小麥品系為K35(隋新霞，黃承彥，楚秀生，李根英，樊慶琦.易花藥培養(yǎng)的早熟小麥新種質(zhì)K35.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007年第一期，116-117頁(yè))，公眾可從山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
YEP液體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，用水定容，pH值為7.0。
YEP固體培養(yǎng)基:在上述 YEP液體培養(yǎng)基中添加瓊脂7g/L。
MS培養(yǎng)基的溶質(zhì)見表1，溶劑為超純水，調(diào)節(jié)pH值為5.8，再按7%的質(zhì)量百分比添加瓊脂后制成固體培養(yǎng)基。
表1.MS培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度
權(quán)利要求
1.培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞的步驟，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)將含有目的DNA表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌接種于胚芽鞘長(zhǎng)為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養(yǎng)所述露白小麥種子獲得處于雌雄蕊分化期的幼穗； 2)取步驟I)得到的處于雌雄蕊分化期的幼穗進(jìn)行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉(zhuǎn)基因小麥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述接種是在所述胚芽鞘長(zhǎng)為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中注入I y L所述含有目的DNA表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述重組農(nóng)桿菌菌液的OD_為0.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述重組農(nóng)桿菌菌液中含有乙酰丁香麗 0.4mmol/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述離體脫分化按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述處于雌雄蕊分化期的幼穗接種于脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得愈傷組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織后，還包括將所述含有所述目的DNA的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得具有根莖葉的小麥植株的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述脫分化培養(yǎng)基和所述分化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的光照條件為:連續(xù)光照，所述 連續(xù)光照的光照強(qiáng)度為1500LUX。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用幼穗拯救獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。該方法通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞，包括如下步驟1)將含有目的DNA表達(dá)載體的重組農(nóng)桿菌接種于胚芽鞘長(zhǎng)為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養(yǎng)所述露白小麥種子獲得處于雌雄蕊分化期的幼穗；2)取步驟1)得到的處于雌雄蕊分化期的幼穗進(jìn)行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉(zhuǎn)基因小麥。本發(fā)明將幼穗拯救法與萌發(fā)種子轉(zhuǎn)化法相結(jié)合獲得轉(zhuǎn)基因小麥，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)12％。本發(fā)明的方法既克服了一般莖尖轉(zhuǎn)化法形成嵌合體的問題，又解決了農(nóng)桿菌直接侵染小麥幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的組織褐化死亡問題，對(duì)小麥品種的遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103205455SQ201210006728
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者李根英, 夏先春, 李玉蓮, 高潔, 宋國(guó)琦, 宋華東, 何中虎, 黃承彥, 樊慶琦, 隋新霞, 楚秀生 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所