專利名稱：靶向gli2的rna拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發明提供用于調節GLI2的表達的化合物、組合物和方法。特別是，本發明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其在細胞中靶向GLI2 mRNA，導致GLI2的表達減少。GLI2表達的減少對一系列醫學病癥，如癌癥有利。相關案件本申請在35 U. S. C. § 119(e)的條件下要求2008年7月16日提交的美國臨時申請序列號US 61/081，135的利益，其公開以其整體在此引入作為參考。本申請還要求2008 年7月15日提交的EP 08104754的優先權。
背景技術：
神經膠質瘤-相關的癌基因2 (Gli2)為含GLI鋅指的轉錄因子的成員，這些轉錄因子在許多細胞類型和大多數器官中涉及細胞命運的決定、增殖和式樣形成。已知人GL2 mRNA經歷可變剪接以產生可變剪接變體。在皮膚角質形成細胞中過表達GL2的轉基因小鼠發生多發性基底細胞癌，表明GL2在這些癌的發生中的作用。US 6，440, 739和TO 03/008545公開了一系列靶向GLI2的2，-甲氧乙基-修飾的嵌合的反義寡核苷酸，且表明這些物質可用于治療與GLI2表達相關的疾病。Kim等人， 2007, Cancer Res. 67 (8) 3583-3593報道了 2，-甲氧乙基-修飾的嵌合的反義寡核苷酸，其用于特異性下調GLI2和降低肝細胞癌細胞體外增殖。需要改善的靶向GLI2的寡聚物。而且，需要靶向GLIl和GLI2兩者的寡聚物。

發明內容
本發明提供10-50個單體，如10-30個單體的寡聚物，其包含10_50個單體，如 10-30個單體的連續序列(第一區)，其中該連續序列(第一區)至少80% (例如，85%， 90%，95%，98%，或99% )等同(同源)于對應于哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3 基因或mRNA的區域或編碼哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶區的反向互補序列，如哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因或mRNA,如具有SEQ ID NO :1和/ 或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的變體。因此， 例如，該寡聚物雜交至具有SEQ ID NO :1中所示序列的單鏈核酸分子的區域。本發明提供10-50個單體，如10-30個單體的寡聚物，其包含10_50個單體，如 10-30個單體的連續序列(第一區)，其中該連續序列(第一區)至少80% (例如，85%， 90%，95%，98%，或99% )等同(同源)于對應于哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3 基因或mRNA的區域，或編碼哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶區的反向互補序列，如哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因或mRNA,如具有SEQ ID NO 1和 /或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的變體；且其中第一區中的至少一個單體為核苷類似物，其中該核苷類似物為鎖核酸(LNA)單體。因此， 例如，該寡聚物雜交至具有SEQ ID NO :1中所示序列的單鏈核酸分子的區域。
本發明提供綴合物，其包含根據本發明的寡聚物，和共價連接至所述寡聚物的至少一個非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本發明提供藥物組合物，其包含根據本發明的寡聚物或綴合物，和藥學可接受的稀釋劑、載體、鹽或佐劑。本發明提供根據本發明的寡聚物或綴合物，其用作藥物，如用于治療本文公開的疾病或醫學病癥，如高增生性病癥，如癌癥或其它高增生性病癥。本發明提供根據本發明的寡聚物或綴合物在制備用于治療本文公開的疾病或病癥，如高增生性疾病，如癌癥的藥物中的用途。本發明提供治療本文公開的疾病或病癥，如高增生性病癥，如癌癥的方法，該方法包括向患有或易患疾病或病癥的動物(如患有或易患疾病或病癥的患者)給藥，例如有效量的，根據本發明的寡聚物、綴合物或藥物組合物。本發明提供在細胞中誘導凋亡的方法，所述方法包括將細胞與以足以引發凋亡的量的根據本發明的寡聚物、綴合物或藥物組合物接觸，其中所述細胞表達GLI2和/或GLIl 和/或GLI3基因或mRNA。在一個實施方案中，該疾病或病癥或狀況與GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或 mRNA的過表達相關。本發明提供在表達GLI2和/或GLIl和/或GLI3的細胞中抑制GLI2和/或GLIl 和/或GLI3的方法，該方法包括將細胞與根據本發明的寡聚物或綴合物接觸以在所述細胞中實現GLI2和/或GLIl和/或GLI3表達的抑制(例如引起對GLI2表達的抑制作用)。本發明還涉及靶向GLIl和GLI2兩者的寡聚物，因此本發明進一步提供在表達 GLI1和GLI2的細胞中抑制GLI1和GLI2兩者的方法，所述方法包括將細胞與根據本發明的寡聚物或綴合物接觸以在所述細胞中抑制GLIl和GLI2兩者的表達(例如對GLIl和GLI2 兩者的表達引起抑制作用)。本發明提供10-50個單體的寡聚物，其包含10-50個連續單體的第一區，其中第一區的序列至少80%等同于相應于哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因的區域或編碼哺乳動物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶區的反向互補序列。本發明進一步提供包含根據本發明的寡聚物的綴合物，其包含至少一個非-核苷酸或非-多核苷酸部分(“綴合的部分”)共價連接至本發明的寡聚物。本發明提供藥物組合物，其包含本發明的寡聚物或綴合物，和藥學可接受的稀釋劑、載體、鹽或佐劑。 本發明進一步提供根據本發明的寡聚物，其用于醫藥。本發明進一步提供本發明的寡聚物在制備用于治療本文涉及的一種或多種疾病， 如選自高增生性病癥，如癌癥，如前列腺癌，神經膠質瘤，結腸直腸癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝細胞癌的疾病的藥物中的用途。本發明進一步提供根據本發明的寡聚物，其用于治療本文涉及的一種或多種疾病，如選自高增生性病癥，如癌癥，如前列腺癌，神經膠質瘤，結腸直腸癌，黑素瘤，乳腺癌， 肺癌或肝細胞癌的疾病。還提供包含本發明的寡聚物的藥物和其它組合物。還提供在細胞或組織中下調 GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表達的方法，其包括將所述細胞或組織在體外或體內與有效量的本發明的一種或多種寡聚物、綴合物或組合物接觸。還提供下調GLIl和GLI2在細胞或組織中表達的方法，其包括將所述細胞或組織在體外或體內與有效量的本發明的一種或多種寡聚物、綴合物或組合物接觸。還公開了治療疑似患有或易患與GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表達或過表達相關的疾病或狀況的動物(非人動物或人)的方法，其通過向非人動物或人給藥治療或預防上有效量的本發明的一種或多種寡聚物、綴合物或藥物組合物。而且，提供了使用寡聚物抑制GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表達，和治療與GLI2和/或GLIl和/或GLI3的活性相關的疾病的方法。本發明提供用于治療選自以下的疾病的方法高增生性病癥，如癌癥，如前列腺癌，神經膠質瘤，結腸直腸癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝細胞癌，該方法包括向需要的動物 (如需要的患者)給藥有效量的一種或多種寡聚物、綴合物或其藥物組合物。本發明提供在細胞或組織中抑制(例如，通過下調)GLI2和/或GLIl和/或GLI3 的表達的方法，該方法包括在體外或體內將細胞或組織與有效量的一種或多種寡聚物、綴合物或其藥物組合物接觸的步驟，以實現GLI2和/或GLIl和/或GLI3表達的下調。本發明提供在細胞或組織中抑制(例如，通過下調)GLI1和GLI2的表達的方法， 該方法包括將細胞或組織在體外或體內與有效量的一種或多種寡聚物、綴合物或其藥物組合物接觸的步驟，以實現GLIl和GLI2的表達的下調。附圖簡述圖 1 人 GLI2 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 1)。GenBank 登記號 NM_005270。圖 2:人 GLIl mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 2)。GenBank 登記號 NM_005269。圖 3:人 GLI3 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 134)。GenBank 登記號 ΝΜ_000168。圖4 用GLI2寡聚物轉染后DU-145細胞中的GLI2 mRNA表達。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。圖5.用GLI2寡聚物轉染后M小時DU-145細胞中的GLI2 mRNA表達。Q-PCR(定量PCR)數據源自用GLI2寡聚物(其可稱為寡聚物(oligos))轉染后M小時的DU-145細胞。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。圖6.用GLI2寡聚物轉染后M小時518A2細胞中的GLI2 mRNA表達。Q-PCR數據源自用GLI2寡聚物轉染后M小時的518A2細胞。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。圖7.用GLI2寡聚物轉染后M小時DU-145細胞中的GLIl mRNA表達。Q-PCR數據源自用GLI2寡聚物轉染后M小時的DU-145細胞。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。圖8.用GLI2寡聚物轉染后M小時518A2細胞中的Glil mRNA表達。Q-PCR數據源自用GLI2寡聚物轉染后M小時的518A2細胞。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。圖9.用GLI2寡聚物轉染后M小時518A2細胞中的GLI3 mRNA表達。Q-PCR數據源自用GLI2寡聚物轉染后M小時的518A2細胞。該數據已用GAPDH mRNA表達標準化且與模擬品中的靶表達(100% )對比。模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。

圖10.小鼠血漿中LNA寡聚物的穩定性測定。該LNA寡聚物在37°C與小鼠血漿溫育，且在0，24，48和120h采取等分部分。結果通過凝膠電泳使用SDS-PAGE凝膠顯影。DNA 硫代磷酸酯用作顯示寡聚物降解的陽性對照寡聚物。使用的寡聚物的SEQ ID No在各凝膠下指示。圖11. DU-145細胞中的增殖測試。使用4nM和20nM最終寡聚物濃度在DU-145細胞中進行MTS測試。具有SEQ ID NO :133中所述序列的寡聚物為用作陰性對照(_ve)的亂序對照。陽性對照(+ve)為在體外和體內都有毒的寡聚物-因此其用作毒性測試中的陽性對照。使用的寡聚物的SEQ ID No在各圖的頂部指示。圖12A和B-血清中的ALT/AST活性。發現給藥具有SEQ ID NO :120所述序列靶向GLI2的寡聚物的組中一只小鼠在第6天死亡，且該組中剩余動物狀態較差且在第6天處死。用具有SEQ ID NO =SEQ ID NO 120所述序列的寡聚物處理的組中的ALT活性太高而不能測量。使用的寡聚物的SEQID No在圖中各柱下指示。圖13. DU-145細胞中的Caspase 3/7測試。使用4nM和20nM最終寡聚物濃度在 DU-145細胞中進行CaSpaSe3/7測試。亂序對照用作陰性對照。模擬品是指無寡聚物對照-即該模擬品轉染的細胞僅用轉染劑轉染(陰性對照)。使用的寡聚物的SEQ ID No在圖中的柱下指示。圖14. 518A2細胞中的Caspase3/7測試。使用4nM和20nM最終寡聚物濃度在 518A2細胞中進行CaSpaSe3/7測試。亂序對照用作陰性對照。模擬品是指無寡聚物對照。 毒性寡聚物(TC)為在體外和體內都顯示毒性且用作陽性對照的寡聚物。使用的寡聚物的 SEQ ID No在圖中的柱下指示。圖1 和15b.具有SEQ ID NO :3，19或75中所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的抗腫瘤作用。使用的寡聚物的SEQ ID No在圖中的柱上指示。在該圖例中，相關SEQ ID NO:在各自量之前(但被逗點隔開)。因此，且作為實例，G2的“ 3，;3mg/kg”表示3mg/kg 的 SEQ ID NO :3ο圖16.具有SEQ ID NO :19，或SEQ ID NO 75所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的腫瘤生長抑制(TGI)。在該圖的注釋中，“亂序對照”是指存活蛋白的亂序對照寡聚物；且 “19” 是指 SEQ ID No 19 (例如 “ 1930mg/kg” 是指 30mg/kg 的 SEQ ID No 19)。圖17.具有 SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 19，或 SEQ ID NO 75 所述序列的寡聚物在 PC3前列腺癌模型中的功效研究(腫瘤生長抑制)。在該圖的注釋中，“3”是指SEQ ID No 3(例如“330mg/kg”是指30mg/kg的SEQ ID No3)；“亂序對照”是指存活蛋白的亂序對照寡聚物；“19” 是指 SEQ ID No 19 (例如“19 30mg/kg” 是指 30mg/kg 的 SEQ ID No 19)；且 “75” 是指 SEQ ID No 75 (例如 “75 10mg/kg，，是指 10mg/kg 的 SEQ ID No 75)。圖18.具有SEQ ID NO 19所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的功效研究 (腫瘤生長抑制)。在該圖的注釋中，“19”是指SEQ ID No 19，“mpk”是指mg/kg，“IP”是指腹膜內給藥；“IV”是指靜脈內給藥；“qlxlO”是指每天10劑；“q2xl0”是指每兩天10劑； 且“q3xl0”是指每三天10劑；例如“193mpk ；IP ；qlxlO”是指每天通過腹膜內給藥的10劑 3mg/kg 的 SEQ ID No 19。圖19.具有SEQ ID NO 19中所述序列的寡聚物在DLD-1結腸直腸癌模型中的功效研究(腫瘤生長抑制)。在該圖的注釋中，“19”是指SEQ ID ■19;“1^1^”是指1^/1^; “Q3xl0”是指每三天10劑；例如“19 ；3mpk ；Q3x4”是指每三天4劑3mg/kg的SEQ ID No 19。圖20a，b和c.具有SEQ ID NO 19中所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的功效研究(腫瘤生長抑制)。在該圖的注釋中，“3”是指SEQ ID No 3，“19”是指SEQ ID No 19;“75”是指SEQ ID No 75 ；“IV”是指靜脈內給藥；“q3x4”是指每三天4劑；例如 “3 3mg/kg ； IV ；q3x4，，是指每三天靜脈內給藥4劑的3mg/kg的SEQ ID No 3。圖21.具有 SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 19，或 SEQ ID NO 75 所述序列的寡聚物在 PC3前列腺癌模型中的腫瘤生長抑制(TGI)。在該圖的注釋中，“3”是指SEQ ID No 3," 19" 是指 SEQ ID No 19;“75” 是指 SEQ ID No 75 ；“ iv” 是指靜脈內給藥；例如“3，3mg/kg，iv” 是指靜脈內給藥3mg/kg的SEQ ID No 3。發明詳述寡聚物本發明使用寡聚化合物(本文稱為寡聚物)，用以調節編碼哺乳動物GLI2和/或 GLIl和/或GLI3(如SEQ ID NO :1中所示的GLI2核酸；或SEQ ID NO :2中所示的GLI2核酸；或如SEQ ID NO 134中所示的GLI2核酸)的核酸分子，和該核酸分子的天然存在的變體的功能。術語“寡聚物”在本發明的情況下是指共價連接兩個或更多個單體形成的分子 (即寡核苷酸)。在一些實施方案中，該寡聚物包含以下或由以下組成10-50個共價連接的單體，如10-30個共價連接的單體，如IO-M個共價連接的單體，如10-18個共價連接的單體，如10-16個共價連接的單體。在一些實施方案中，術語“核苷”、“核苷酸”、，，單元”和“單體”可互換使用。應認識到當提到核苷酸或單體的序列時，所指的為堿基，如A，T，G，C或U的序列。如本文所述，術語“核苷酸”是指包含糖部分、堿基部分和共價連接的基團(連接基)如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸間連接基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸，如DNA或 RNA，和包含修飾的糖和/或堿基部分的非天然存在的核苷酸，其在本文也稱為“核苷酸類似物”。在此，單核苷酸(單元)也可稱為單體或核酸單元。在生物化學領域，術語“核苷”通常用來表示包含糖部分和堿基部分的糖苷，且因此當涉及“核苷酸”單元時可使用，該“核苷酸”單元通過寡聚物的核苷酸之間的核苷酸間連接共價連接。在生物技術領域，術語“核苷酸”通常用來表示核酸單體或單元，且因此在寡核苷酸的情況下可表示堿基-如“核苷酸序列”，通常是指核堿基序列(即暗示存在糖主鏈和核苷間連接)。同樣，特別是在寡核苷酸的情況下(其中一個或多個核苷間連接基被修飾)，術語“核苷酸”可表示“核苷”，例如術語“核苷酸”即使當指定核苷之間的連接的存在或性質時也可使用。本領域技術人員應理解，在本發明的范圍內，寡核苷酸(寡聚物)的5’端核苷酸不包括5’核苷酸間連接基，盡管其可能包括或可能不包括5’末端基。術語“單體”包括核苷和脫氧核苷兩者(統稱為，“核苷”)，其天然存在于核酸中且不包含修飾的糖或修飾的核堿基，即，其中核糖或脫氧核糖共價連接至天然存在的、未修飾的核堿基(堿基)部分(即，嘌呤和嘧啶雜環腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶) 的化合物，以及“核苷類似物”，其為天然存在于核酸中或不天然存在于核酸中的核苷，其中糖部分不為核糖或脫氧核糖(如雙環糖或2’修飾的糖，如2’取代的糖)，或堿基部分被修飾(例如，5-甲基胞嘧啶)，或兩者。"RNA單體”為包含核糖和未修飾的核堿基的核苷。"DNA單體”為包含脫氧核糖和未修飾的核堿基的核苷。“鎖核酸單體”、“鎖單體”或“LNA單體”為具有雙環糖的核苷類似物，如下文進一步描述的。術語"對應于"和"相應于"是指寡聚物或連續核苷酸/核苷序列(第一區)的核苷酸/核苷序列(即核堿基或堿基序列)與另一序列的等效(equivalent)連續核苷酸/ 核苷序列的比較，所述另一序列選自i)核酸靶的反向互補序列的子序列，和/或ii)本文提供的核苷酸/核苷的序列。核苷酸/核苷類似物直接與它們的等效或對應核苷酸/核苷比較。在i)或ii)下對應于另一序列的第一區通常在第一區(如連續核苷酸/核苷序列) 的長度上等同于該序列，或如本文所述，在一些實施方案中，可至少80%同源于對應序列， 如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96% 同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源，如100%同源(相同)。術語“對應核苷類似物”和“對應核苷”表明核苷類似物中的堿基部分和核苷中的堿基部分相同。例如，當“核苷”包含連接至腺嘌呤的2’ -脫氧核糖時，該“對應核苷類似物”包含，例如，連接至腺嘌呤堿基部分的修飾的糖。術語“寡聚物”、“寡聚化合物”和“寡核苷酸”可在本發明中互換使用，且是指通過例如磷酸酯基(在核苷之間形成磷酸二酯連接)或硫代磷酸酯基(在核苷之間形成硫代磷酸酯連接)共價連接兩個或更多個單體形成的分子。該寡聚物由以下組成或包含以下 10-50個單體，如10-30個單體，如10-24個單體，如10-18個單體，如10-16個單體。該寡聚物由第一區(連續序列)組成或包含第一區(連續序列)，該第一區(連續序列)，例如， 由9-30個連續單體，如9- 個單體，如9-18個單體，如9-16個單體組成。在一些實施方案中，術語“連續序列”、“連續單體”和“區域”可互換。在一些實施方案中，寡聚物包含本文所述的核苷、或核苷類似物、或其混合物。 "LNA寡聚物”或“LNA寡核苷酸”是指包含一個或多個LNA單體的寡核苷酸。任選包含在寡聚物中的核苷類似物可類似于對應核苷起作用，或可具有特定改善的功能。其中一些或所有單體為核苷類似物的寡聚物通常優于天然形式，因為該寡聚物的一些理想特性，如穿透細胞膜的能力，對細胞外和/或細胞內核酸酶良好的抗性和對核酸靶的高親和力和特異性。LNA單體是特別優選的，例如，用于給予一種或多種上述性質。在多種實施方案中，寡聚物中存在的一種或多種核苷類似物在功能上“沉默 (silent) ”或“等效(equivalent) ”于對應天然核苷，即對于寡聚物抑制靶基因表達的作用方式沒有功能上的影響。如果例如，它們更容易制備或制備更廉價，或對儲存或制備條件更穩定，或可摻入標簽或標記，這種“等效”核苷類似物還是可以使用的。然而，通常，該類似物將對寡聚物抑制表達的作用方式有功能上的影響；例如通過產生增加的對靶核酸的靶區的結合親和力和/或增加的對核酸酶如細胞內核酸酶的抗性、和/或更方便性地轉運至細胞。因此，在多種實施方案中，根據本發明的寡聚物包含核苷單體和至少一種核苷類似物單體，如LNA單體，或其它核苷類似物單體。
術語“至少一種(個)”包含大于或等于1的整數，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20等等。在多種實施方案中，如當涉及本發明的寡聚物的核酸或蛋白質靶，術語“至少一種(個)”包括術語“至少二種(個)”和“至少三種(個)”和 “至少四”種(個)。同樣，在一些實施方案中，術語“至少二種(個)”包括術語“至少三種 (個)”和“至少四種(個)，，。在一些實施方案中，該寡聚物在第一區包含以下或由以下組成9，10，11，12，13， 14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 個連續單體。在一些實施方案中，該寡聚物包含以下或由以下組成10- 個連續單體，如 10-22個連續單體，如10-18個連續單體，如10-16個連續單體，如12-18個連續單體，如 13-17或12-16個連續單體，如13，14，15，16或M個連續單體。應理解當對寡聚物或連續核苷酸序列長度給予一個范圍，其包括在該范圍內提供的上限和下限長度，例如從10-30(或 10-30之間)，包括10禾口 30。在某些實施方案中，該寡聚物包含以下或由以下組成10，11，12，13，或14個連續單體。在多種實施方案中，根據本發明的寡聚物由不超過M個單體組成，如不超過22個單體，如不超過20個單體，如不超過18個單體，如15，16或17個單體。在一些實施方案中， 本發明的寡聚物包含少于20個單體。在多種實施方案中，本發明的寡聚物不包含RNA單體。在多種實施方案中，根據本發明的寡聚物為直鏈分子或合成為直鏈分子。該寡聚物，在該實施方案中，為單鏈分子，且通常不包含例如，至少3，4或5個連續單體的短區，該短區與相同寡聚物內的另一區互補，使得寡聚物形成內部雙鏈體。在一些實施方案中，該寡聚物基本上不為雙鏈的，即，不為siRNA。在一些實施方案中，本發明的寡聚物由單體(第一區)的連續段(contiguous stretch)組成，其序列通過本文公開的SEQ ID NO辨別(參見，例如，表1_3)。在其它實施方案中，該寡聚物包含第一區，該區由編碼靶的核酸分子的單體的連續段和一個或多個由至少一個其他單體組成的其它區組成。在一些實施方案中，第一區的序列通過本文公開的 SEQ ID NO 辨別。缺口聚物設計通常，本發明的寡聚物為缺口聚物。“缺口聚物”是包含一段連續的單體的寡聚物，該單體能募集RNA酶(如RNA酶H)， 其在以下進一步詳述，如至少6或7個DNA單體的區域，在本文稱為B區。B區的5’和3’ 端的兩個側翼為分別稱為A區和C區的區域，A區和C區的每一個包含核苷類似物或由核苷類似物組成，如增強親和力的核苷類似物，如1-6個核苷類似物。該RNA酶優選為RNA酶 H，如大腸桿菌或人RNA酶H。當寡聚物與互補RNA分子(如mRNA靶)形成雙鏈體時測定寡聚物募集RNA酶H的能力。在一些實施方案中，能募集RNA酶的單體選自DNA單體，α -L-LNA單體， C4，烷基化 DNA 單體(參見 PCT/EP2009/050;349 和 Vester 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008)2^6-2300，在此引入作為參考)，和UNA (未鎖核酸)核苷酸(參見Fluiter 等人，Mol. Biosyst.，2009，10，1039在此引入作為參考)。UNA為未鎖核酸，通常其中糖的C2’ -C3’鍵(即C2’和C3’碳之間的共價碳-碳鍵)已被去除，形成未鎖的“糖”殘基。通常，該缺口聚物包含下式的區域(5’至3’)A-B_C，或任選A-B-C-D或D-A-B-C， 其中A區(A)由以下組成或包含以下至少一個核苷類似物，如至少一個LNA單體，如1-6 個連續核苷類似物，如LNA單體，且B區由以下組成或包含以下至少5個能募集RNA酶(當與靶RNA分子的互補靶區，如mRNA靶形成雙鏈體時)的連續單體，如DNA單體；C區(C)由以下組成或包含以下至少一個核苷類似物，如至少一個LNA單體，如1-6個連續核苷類似物，如LNA單體；且D區⑶，當存在時由以下組成或包含以下1，2或3個單體，如DNA單體。在多種實施方案中，A區由1，2，3，4，5或6個核苷類似物，如LNA單體，如2_5個核苷類似物，如2-5個LNA單體，如3或4個核苷類似物，如3或4個LNA單體組成；和/或C 區由1，2，3，4，5或6個核苷類似物，如LNA單體，如2-5個核苷類似物，如2-5個LNA單體， 如3或4個核苷類似物，如3或4個LNA單體組成。在某些實施方案中，B區由以下組成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12個能募集 RNA酶如RNA酶H的連續單體(例如連續核苷酸)，或6_10，或7_9個連續單體，如10或9 或8個能募集RNA酶的連續單體。在某些實施方案中，B區由以下組成或包含以下至少一個DNA單體，如1-12個DNA單體，優選4-12個DNA單體，更優選6-10個DNA單體，如7_10 個DNA單體，最優選8，9或10個DNA單體。在多種實施方案中，A區由3或4個核苷酸類似物(如LNA單體)組成，B區由 7，8，9或10個DNA單體組成，且C區由3或4個核苷類似物(如LNA單體)組成。這些設計包括(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3， 3-7-4，4-7-3，且可進一步包括D區，其可具有1個或2個單體，如DNA單體。其他缺口聚物設計公開于W02004/046160，其在此引入作為參考。W02008/113832(其要求美國臨時申請60/977，409的優先權)在此引入作為參考， 是指‘短聚物(shortmer) ’缺口聚物寡聚物。在一些實施方案中，本文提供的寡聚物可為該短聚物缺口聚物。在某些實施方案中，該寡聚物由10，11，12，13，14，15或16個單體組成，其中該寡聚物的區域具有圖式(5’-3’)^3-(，或任選4-8-(-0或0^-(，其中A區由1，2或3個核苷類似物單體(如LNA單體)組成；B由7，8，9或10個連續單體組成，其能募集RNA酶， 如RNA酶H;且C區由1，2或3個核苷類似物單體(如LNA單體)組成。當存在時，D區由單一 DNA單體組成。在某些實施方案中，A區由1個LNA單體組成。在某些實施方案中，A區由2個LNA 單體組成。在某些實施方案中，A區由3個LNA單體組成。在某些實施方案中，C區由1個 LNA單體組成。在某些實施方案中，C區由2個LNA單體組成。在某些實施方案中，C區由3 個LNA單體組成。在某些實施方案中，B區由7個核苷單體組成。在某些實施方案中，B區由8個核苷單體組成。在某些實施方案中，B區由9個核苷單體組成。在某些實施方案中，B 區由10個核苷單體組成。在某些實施方案中，B區包括1-10個DNA單體，如2，3，4，5，6，7， 8或9個DNA單體。在某些實施方案中，B區包括1-9個DNA單體，如2，3，4，5，6，7或8個 DNA單體。在某些實施方案中，B區由DNA單體組成。在某些實施方案中，B區包括至少一個 LNA單體，其為α-L構型，如α-L-構型的2，3，4，5，6，7，8，9或10個LNA單體。在某些實施方案中，B區包括至少一個α-L-氧基LNA單體。在某些實施方案中，在B區為α-L-構型的所有LNA單體為α -L-氧基LNA單元。在某些實施方案中，A-B-C區存在的單體數量分別選自(核苷類似物單體-B區-核苷類似物單體)1-8-1，1-8-2，2-8-1,2-8-2, 3-8-3, 2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4,2-8-4，或；1—9—1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，
1-9-3，3-9-1，3-9-3，4-9-1，1—9—4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1-10-3,3-10-1，
2-10-3，3-10-2，或3-10-3。在某些實施方案中，本發明的寡聚物的A-B-C區中存在的單體數量分別選自2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4 和 4-7-3。在某些實施方案中，A和C區中的每一個由3個LNA單體組成，且B區由8或9或10個核苷單體，優選DNA 單體組成。在某些實施方案中，A和C區中的每一個由兩個LNA單體組成，且B區由8或9 個核苷單體，優選DNA單體組成。在多種實施方案中，其它缺口聚物設計包括以下那些其中A和/或C由3，4， 5或6個核苷類似物組成，該核苷類似物如包含2’ -0-甲氧乙基-核糖(2’ -Μ0Ε)的單體或包含2’ -氟-脫氧核糖的單體，且B區由8，9，10，11或12個核苷，如DNA單體組成，其中區域A-B-C具有3-9-3，3-10-3，5-10-5或4-12-4單體。其他缺口聚物設計公開于WO 2007/146511Α2，在此引入作為參考。核苷間連接本文所述的寡聚物的單體通過連接基偶聯在一起。適當地，各單體通過連接基連接至3’鄰接單體。具有本領域普通技術的人員應理解，在本發明的范圍內，在寡聚物末端處的5’單體不包含5’連接基，盡管其可能或可能不包含5’末端基。術語"連接基"和“核苷間連接”是指能將兩個連續單體共價偶聯在一起的基團。 具體的和優選的實例包括磷酸酯基(phosphate group)(在相鄰核苷單體之間形成磷酸二酯)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate group)(在相鄰核苷單體之間形成硫代磷酸酯連接)。合適的連接基包括W02007/031091所列的那些，例如在W02007/031091第34頁第一段(在此引入作為參考)。在多種實施方案中，優選將連接基從其正常磷酸二酯修飾為對核酸酶侵襲更有抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-這兩個可被RNA酶H裂解，從而允許RNA酶-介導的靶基因表達的反義抑制。在一些實施方案中，本文提供的合適的含硫( 連接基是優選的。在多種實施方案中，優選硫代磷酸酯連接基，特別對于缺口聚物的缺口區域(gap region) (B) 0在某些實施方案中，使用硫代磷酸酯連接在側翼區(A和C)中將單體連接在一起。在多種實施方案中，使用硫代磷酸酯連接將A或C區連接至D區，且用于在D區內將單體連接在一起。在多種實施方案中，A、B和C區，包含除了硫代磷酸酯之外的連接基，如磷酸二酯連接，特別是，例如當使用核苷類似物保護A和C區中的連接基避免內切核酸酶降解-如當 A和C區包含LNA單體。在多種實施方案中，寡聚物的鄰接單體通過硫代磷酸酯基彼此連接。已認可將磷酸二酯連接，如一個或兩個連接，摻入具有硫代磷酸酯主鏈的寡聚物， 特別是在核苷類似物單體之間或附近具有硫代磷酸酯連接基的寡聚物(典型在A區和/或C區中)，可修飾寡聚物的生物利用度和/或生物分布-參見W02008/053314，在此引入作為參考。在一些實施方案中，如以上涉及的實施方案，其適合且不特別指示，所有剩余的連接基為磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些實施方案中所有核苷間連接基為硫代磷酸酯。當涉及具體的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，應理解，在多種實施方案中，當連接為硫代磷酸酯連接時，可使用替代連接，如本文公開的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)連接，特別是對于核苷類似物，如LNA單體之間的連接。同樣，在多種實施方案中，當涉及具體的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，當A或C區中的一個或多個單體，如LNA單體，包含5-甲基胞嘧啶堿基，該區域中的其它單體可包含未修飾的胞嘧啶堿基。靶核酸術語“核酸”和“多核苷酸”在此可互換使用，并定義為通過共價連接兩個或更多個單體形成的分子，如上所述。“核酸”可為任何長度，包括2個或更多個單體，且該術語的上位概念為“寡聚物”，其具有本文所述的長度。術語“核酸”和“多核苷酸”包括單鏈、雙鏈， 部分雙鏈，和環狀分子。在一些實施方案中，術語“靶核酸”，如本文所述，是指編碼哺乳動物GLI2多肽，如人GLI2的DNA或RNA (例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO 1所示序列的核酸，和這些核酸天然存在的等位變體。在某些實施方案中，該哺乳動物GLI2為小鼠GLI2。在一些實施方案中，術語“靶核酸”，如本文所述，是指編碼哺乳動物GLIl多肽，如人GLIl的DNA或RNA(例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO :2中所示序列的核酸，和這些核酸天然存在的等位變體。在某些實施方案中，該哺乳動物GLIl為小鼠GLI1。在一些實施方案中，術語“靶核酸”，如本文所述，是指編碼哺乳動物GLI3多肽，如人GLI3的DNA或RNA (例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO 134所示序列的核酸，和這些核酸天然存在的等位變體。在某些實施方案中，該哺乳動物GLI3為小鼠GLI3。在一些實施方案中，例如當在研究或診斷中使用時，該“靶核酸”為由上述DNA或 RNA核酸靶衍生的cDNA或合成寡核苷酸。根據本發明的寡聚物通常能雜交至靶核酸。示例性靶核酸包括具有下表所示GenBank登記號的編碼哺乳動物GLI2的核酸，以及它們相應的蛋白質序列
權利要求
1.長度為10-30個單體的寡聚物，其包含總共10-30個單體的連續序列的第一區，其中所述連續序列至少80%等同于對應于哺乳動物GLI2基因的區域或編碼哺乳動物GLI2的核酸的靶區的反向互補序列，如哺乳動物GLI2基因或mRNA，如具有SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的變體。
2.根據權利要求1的寡聚物，其中所述連續序列至少80%，優選至少90%與對應于SEQ ID NO 19，3-18和20-90的任何的區域同源。
3.根據權利要求1或2的寡聚物，其中所述連續序列與SEQID NO 1,SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 134的對應區的反向互補序列相比不包含錯配或包含不超過1個或2個錯配。
4.根據權利要求1至3任一項的寡聚物，其中該連續序列的長度為9-18個核苷酸。
5.根據權利要求1至4任一項的寡聚物，其中該連續序列包括核苷類似物。
6.根據權利要求5的寡聚物，其中該核苷類似物為糖修飾的核苷，如選自以下的糖修飾的核苷鎖核酸(LNA)單元；2’ -0-烷基-RNA單元，2’ -OMe-RNA單元，2’ -氨基-DNA單元和2’ -氟-DNA單元；優選該核苷類似物為LNA0
7.根據權利要求5或6的寡聚物，其為缺口聚物。
8.根據權利要求1至7任一項的寡聚物，其在表達GLI2基因或mRNA的細胞中抑制 GLI2基因或mRNA的表達；優選所述寡聚物選自SEQ ID NO 112，114，118，120，130和132 ； 更優選所述寡聚物為SEQ ID No 118或SEQ ID No 132。
9.綴合物，其包含根據權利要求1至8任一項的寡聚物，和至少一種共價連接至所述寡聚物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
10.藥物組合物，其包含根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或根據權利要求9的綴合物，和藥學可接受的稀釋劑、載體、鹽或佐劑。
11.根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或根據權利要求9的綴合物，其用作藥物，如用于治療高增生性病癥，如癌癥。
12.根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或權利要求9限定的綴合物在制備用于治療高增生性病癥，如癌癥的藥物中的用途。
13.治療高增生性病癥，如癌癥的方法，所述方法包括向患有或可能患有高增生性病癥，如癌癥的動物給藥根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或根據權利要求9的綴合物， 或根據權利要求10的藥物組合物。
14.在表達GLI2的細胞中抑制GLI2的方法，所述方法包括向所述細胞給藥根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或根據權利要求9的綴合物以在所述細胞中抑制GLI2。
15.在表達GLI2的細胞中誘導凋亡的方法，所述方法包括向所述細胞給藥足以引發凋亡的量的根據權利要求1至8任一項的寡聚物，或根據權利要求9的綴合物，或根據權利要求10的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發明涉及寡聚物化合物(寡聚物)，其在細胞中靶向GLI2 mRNA，導致GLI2表達減少。GLI2表達減少有利于治療某些醫學病癥，如高增生性病癥，如癌癥。
文檔編號C12N15/113GK102159712SQ200980135884
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月15日 優先權日2008年7月15日
發明者馬杰·赫德賈恩 申請人:安佐制藥股份有限公司, 桑塔里斯制藥公司