專利名稱：全人源的抗人白介素21受體的單鏈抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種可與人白介素21受體特異結合的高親和力全人源單鏈抗體。
背景技術：
人白介素21 (IL-21)是最近發現的一種具有“四螺旋束”結構的I型細胞因子，其結構與IL-2、IL-4和IL-15相似。IL-21主要由活化的⑶4+T細胞產生，在淋巴細胞成熟及增殖中發揮重要作用。人白介素21受體(IL-21R)是淋巴組織，尤其是NK、B和T細胞所表達的I型細胞因子受體，是細胞因子IL-21的特異性受體。人白介素21受體的基因定位于16pll，其 cDNA的ORF編碼538個氨基酸。IL-21R蛋白由前導序列、WSXWS基元、跨膜結構域、細胞外結構域和細胞內結構域組成，其結構與IL-2受體P鏈和IL-4受體a鏈高度同源。與配體結合時，IL-21R與共有的Y細胞因子受體鏈UC)結合，引起STATl和STAT3或STAT5 磷酸化產生生物學效應。IL-2IR在淋巴組織中廣泛分布，包括脾、胸腺、外周血淋巴細胞和淋巴結。此外，流量血細胞計數還發現IL-21R表達于Jurkat (人急性T淋巴細胞白血病)、 Raji (人Burkitt淋巴瘤)、NK-92、頂_9(人B細胞系)等細胞表面。IL-21R的廣泛淋巴細胞分布暗示其可能在免疫調控中起重要作用。事實上已研究征實，IL-21與IL-21R結合顯著地調節B細胞、⑶4+T細胞以及NK細胞的增殖和活性， IL-21還介導由T細胞、NK細胞、巨噬細胞和滑膜細胞分泌的細胞因子和趨化因子的表達。 在一些動物模型中已研究證實，通過降低IL-21R活性可改善關節炎、移植排斥等自身免疫性疾病，如在膠原誘發關節炎小鼠爪中，IL-21R mRNA表達上調；類風濕性關節炎患者外周血單核細胞中，IL-21R mRNA表達明顯增加；在哮喘模型中，IL-21R缺陷型小鼠表現出癥狀減輕；IL-21R缺陷型小鼠，其B細胞合成的抗原特異性IgG數量減少。此外，在急性淋巴瘤及濾泡瘤細胞可檢測到大量IL-21R，抗IL-21R的抗體可治療IL-21R應答細胞活性異常相關的過度增殖性疾病，如白血病癌癥、骨髓和淋巴組織的腫瘤。因此抑制IL-21R的活性會調節IL-21R介導的免疫應答，可用于治療、改善和預防包括炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、移植排斥、銀屑病、哮喘和系統性紅斑狼瘡(SLE)的炎性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤。抗人IL-21R抗體還可作診斷使用或作為祀向抗體向表達IL-21R的細胞傳遞治療性或細胞毒性試劑。近10兒年來，抗體治療免疫系統疾病已成為研究熱點。隨著免疫學和分子生物學的不斷發展，尤其是噬菌體表面展示技術的不斷完善，為制備用于早期診斷和靶向治療免疫性疾病的特異性抗體提供了一個高效的平臺。目前國內外治療自身免疫性疾病的抗體大部分是嵌合抗體或人源化的鼠源性抗體。盡管人源化在很大程度上可以減少鼠源性抗體的免疫原性，但不能徹底去除其免疫原性，因而在臨床治療中不可避免地會中和抗體而降低其治療價值。采用噬菌體篩選技術從全人源的單鏈抗體庫中獲得的抗體完全為人源，對人體沒有免疫原性，可更為有效激活人體的生物效應功能，并且單鏈抗體(scFv)分子量小，保留了全分子抗體結合抗原的部位(重鏈和輕鏈可變區)，是理想的靶向藥物。因此，從全人源的單鏈抗體庫中直接篩選高親和力的抗人白介素21受體的單鏈抗體將為自身免疫性疾病及腫瘤的早期診斷和靶向性治療藥物研究作出重要貢獻。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種具有潛在醫學和藥學價值的全人源抗人白介素21受體的單鏈抗體。本發明單鏈抗體的特征為特異性結合人IL-21R胞外區，在體外能夠抑制表達 IL-21R的Jurkat細胞增殖。技術方案一種全人源的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于抗人白介素21受體單鏈抗體包括重鏈可變區域和輕鏈可變區域，重鏈可變區域和輕鏈可變區域分別包括3個互補決定區⑶R1-3，且重鏈可變區域和輕鏈可變區域之間通過柔性肽連接，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ ID NO :9。所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈⑶R2域，該域包含SEQ ID NO 4 的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈⑶Rl域，該域包含SEQ ID NO 3 的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于重鏈可變區域的氨基酸序列為SEQ IDNO :1，輕鏈可變區域的氨基酸序列為SE ID NO :2，一種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼所述的全人源抗人白介素21受體的單鏈抗體。—種表達載體，含有所述的核酸。一種重組宿主細胞，含有所述的表達載體。上述任一項的抗體或抗體片段的偶聯物。上述任一項的抗體或偶聯物的應用，其特征在于制備抑制或中和IL-21R活性的診斷試劑和治療劑。發明進一步說明本發明中全人源抗人白介素21受體單鏈抗體的基因序列全長732個核苷酸，有 244個氨基酸。具有116個氨基酸的重鏈可變區(SEQ ID NO I)和112個氨基酸的輕鏈可變區(SEQID NO :2)，通過16個氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID NO 9)。
含有本發明白介素21受體單鏈抗體基因的表達載體和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增本發明單鏈抗體基因的任意片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的另一個目的是提供一種可以表達和純化上述抗IL-21R單鏈抗體的方法。本發明通過噬菌體展示抗體庫技術，以人白介素21受體胞外區蛋白為靶抗原， 篩選得到一個能特異性結合IL-21R的全人源單鏈抗體C2 ;用0. lmmol/L IPTG誘導表達；利用超聲破碎細胞，低溫離心去除細胞碎片，將上清過鎳親和層析柱進行分離純化；經 SDS-PAGE及Western Blot鑒定分離純化得到的可溶性單鏈抗體C2，分子量約為30kD ;定量ELISA檢測單鏈抗體C2與白介素21受體的親和力；細胞增殖實驗檢測單鏈抗體C2對的表達IL-21R的Jurkat細胞的生長抑制作用。本發明得到的抗白介素21受體單鏈抗體與白介素21受體的結合具有高特異性， 親和力達到I. 32X10_8M，體外抑制細胞生長實驗結果表明，本發明得到的單鏈抗體可以明顯抑制高表達IL-21R的.Jurkat細胞的生長，并且抑制作用與單鏈抗體C2呈濃度依賴性， IC50約7. 8X 10_8M。本發明為治療和診斷以白介素21受體抗原的表達為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關疾病包括但不限于自身免疫性疾病及腫瘤。


圖I單鏈抗體C2的結構示意圖。圖2單鏈抗體C2的重鏈可變區的氨基酸序列，在所述互補決定區VH-⑶R1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 下劃線。圖3單鏈抗體C2的輕鏈可變區的氨基酸序列，在所述互補決定區VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 下劃線。圖4SDS-PAGE蛋白質電泳圖，描述發酵表達的C2通過鎳柱親和層析純化后的結果，泳道M為蛋白分子量標準，泳道1、2為菌體周質提取物上清，泳道3為20mM咪唑洗滌流出液，泳道4 7為50mM咪唑洗滌流出液，泳道8、9為IOOmM咪唑洗脫目的蛋白。圖5Western Blot鑒定分離純化得到的C2。圖6C2的親和力測定。圖7MTT法測定全人源抗IL-21R單鏈抗體C2對Jurkat細胞的生長抑制作用。以下借助非限制性實施例舉詳細描述本發明。對本領域技術人員而言，在不背離本發明精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，特別是對若干部件的等同替換，都構成對本發明專利權的侵犯，將承擔相應的法律責任。
具體實施例方式實施例中涉及的百分比，其中固體試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。實施例I全人源抗IL-21R單鏈抗體的篩選以包被緩沖液(IOOmM Tris, NaCl 150mM, pH9. 0)稀釋IL-21R胞外區蛋白(購自北京義翹神州生物技術公司)至IOOy g/ml，取4ml加入到免疫管中，室溫包被過夜；次日， 棄上清，以PBS迅速洗管3次；將免疫管中注滿2% MPBS (含有2%脫脂牛奶的PBS)，37°C封閉2h ;棄封閉液,用PBS迅速洗管3次;將卩遼菌體抗體庫(1012 IO13P. f. u) (Dana library, 哈佛醫學院捐贈)懸浮于4ml 2%MPBS并加入到免疫管中，室溫反復倒轉30min后，于室溫靜置90min以上；棄上清，以含有0. 1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污劑JfPBS吸干后加入Iml IOOmM三乙胺(700 7. 18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室溫反復倒轉IOmin,進行特異性洗脫；加入0. 5ml I M Tris (pH7. 4)迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體感染處于對數期的大腸桿菌TGl ;再用輔助性噬菌體超感染的方法從感染并擴增了的TGl制備噬菌體，進行第二輪篩選如此反復進行“吸附洗脫-感染-擴增”的篩選過程共4輪。實施例2抗IL-21R單鏈抗體的可溶性表達及分離純化挑選測序正確的TGl菌株，收集噬菌粒，按常規操作(抗體藥物工程，P51)感染表達大腸桿菌HB2151，培養至0D600nm ^ 0. 6，加入終濃度0. ImM的IPTG，20°C誘導過夜，12% SDS-PAGE檢測誘導表達結果。6000rpm 4°C離心5min,收集菌體；PBS重懸菌體,加入lmmol/L的苯甲基磺酰氟化物，超聲破碎(超聲2s,間隙2s,共IOmin) ；12000rpm 4°C離心20min,收集上清；將上清過鎳親和層析柱(購自GE)，用不同濃度的咪唑洗脫；12% SDS-PAGE檢測純化的結果(見圖 4)，_20°C保存目的蛋白，命名為C2，其氨基酸序列為SEQ ID NO :I和SEQ ID NO :2，由SEQ ID NO :9 相連。實施例3抗IL-21R單鏈抗體的Western Blot鑒定純化得到的C2進行變性SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12 % ；4°C, IOOmA恒流轉印2h，將蛋白轉印到PVDF膜(購自Millipore);轉印結束后，將膜在5 % MTBS (含有 5%脫脂牛奶的TBS)中4°C封閉過夜；用5% MTBS按I : 2000稀釋anti-His鼠抗體 (購 Millipore)，37°C 孵育 I. 5h，TBS 洗 3 遍，每次 5min ;用 5 % MTBS 按 I : 5000 稀釋 HRP-anti-Mouse 二抗(購自聯科生物)，37°C孵育I. 5h，TBS洗3遍，每次5min ;用DAB顯色。(見圖5)實施例4可溶性單鏈抗體C2的親和力鑒定用Iy g/ml和0. g/ml兩種不同濃度的IL-21R重組蛋白包被ELISA板過夜， 次日，PBS洗板3次，每孔加入200 ill 3% BSA-PBS室溫封閉2h，然后加入從10 y g/ml 到10ng/ml兩倍倍比稀釋的純化過的單鏈抗體C2，室溫孵育90min，以PBST (含有0. 05% Tween20的PBS)洗板3次，每孔加入100 U I用封閉液I : 1000稀釋后的anti-His鼠抗體，室溫孵育90min ；以PBST洗板3次，加入100 U I用封閉液I : 5000稀釋后的HRP-羊抗小鼠IgG，室溫孵育90min ;以PBST洗板3次，再以PBS洗板3次，最后用TMB顯示；根據 ELISA讀數繪制親和力曲線，求出l/2Max 0D450對應I y g/ml和0. 5 y g/ml IL-21R的抗體濃度，分別記為[Ab](對應于I u g/ml IL-2 IR)和[Ab] ’ (對應于0. 5 u g/ml IL-2 IR)，然后用公式2[Ab] ’ -[Ab]計算單鏈抗體的親和力。根據圖6，我們得出以下結論本發明中的單鏈抗體C2與重組人白介素21受體胞外區蛋白的親和力達到1.32X10_8M.因此，本發明的人源性單鏈抗體C2具有高親和力、特異性結合人白介素21受體胞外區的功能及免疫疾病診斷與靶向治療的潛在價值。實施例5抗IL-21R單鏈抗體對Jurkat細胞的生長抑制作用10ng/ml乙酰豆蘧佛波酯PMA和I ii g/ml Ionomycin (購自福麥斯生物)刺激16h的Jurkat細胞(購自上海細胞庫)，以2 X 106/ml接種96孔細胞培養板，50 U I/孔，將培養的Jurkat細胞分為5組，按照分組要求加入無血清1640培養液2倍梯度稀釋的單鏈抗體C2，每孔50iU，在37°C 5% CO2培養箱中培養48h，觀察細胞生長狀況后每孔加入Ilyl 的MTT，37°C繼續培養4h，3000rpm離心5min，傾去上清，每孔加入150 u I DMS0，用酶標儀測定每孔570nm/630nm波長處的吸光值(0D值)，記錄結果，以單鏈抗體C2的濃度為橫坐標， 570/630nm光吸收值為縱坐標繪制細胞生長曲線，并通過標準方法測定IC5(I。結論由于人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞經PMA和Ionomycin刺激后表面可大量表達IL-21R，為了檢測單鏈抗體C2對表達有天然構象IL-21R的Jurkat細胞的作用，我們用不同濃度C2測定其對Jurkat細胞的生長抑制作用。結果表明，本發明得到的單鏈抗體可以明顯抑制Jurkat細胞生長，并且抑制作用與單鏈抗體C2呈濃度依賴性，IC50約 7.8X10_8M。具體結果由圖7所示。
權利要求
1.抗人白介素21受體單鏈抗體包括重鏈可變區域和輕鏈可變區域，重鏈可變區域和輕鏈可變區域分別包括3個互補決定區⑶R1-3，且重鏈可變區域和輕鏈可變區域之間通過柔性肽連接，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ ID NO :9。
2.根據權利要求I所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
3.根據權利要求I所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
4.根據權利要求I所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，具有重鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
5.根據權利要求I所述的抗人白介素21受體的單鏈抗體，其特征在于重鏈可變區域的氨基酸序列為SEQ ID NO :1，輕鏈可變區域的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
6.一種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼權利要求I的全人源抗人白介素21受體的單鏈抗體。
7.—種表達載體,含有權利要求6所述的核酸。
8.—種重組宿主細胞，含有權利要求7所述的表達載體。
9.偶聯物含有權利要求I 5任一項的抗體或抗體片段。
10.權利要求I 4或9中任一項的抗體或偶聯物的應用，其特征在于制備抑制或中和 IL-21R活性的診斷試劑和治療劑。
全文摘要
本發明屬基因工程抗體技術領域，具體地公開了一種全人源抗人白介素21受體的單鏈抗體C2，及其制備方法和用途。本發明還公開了C2的重鏈可變區和輕鏈可變區免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括對應于互補決定區CDR1、CDR2和CDR3的序列。本發明還提供表達C2的方法，從天然人源噬菌體抗體庫中篩選得到一株全人源抗人白介素21受體單鏈抗體C2，通過原核系統分泌表達、鎳柱親和層析純化獲得單鏈抗體。本發明的單鏈抗體可特異性結合于人白介素21受體，能抑制白介素21受體的活化，適應于治療與白介素21受體有關的疾病，包括類風濕性關節炎、移植排斥的自身免疫疾病和其它免疫系統疾病，亦可以應用于偶聯于可檢測物質和治療劑。
文檔編號C12N15/13GK102532320SQ20121005569
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者吳沁航, 張娟, 王彤, 王旻, 羅辰 申請人:中國藥科大學