專利名稱：人血清白蛋白與白介素1受體拮抗劑融合蛋白的表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白表達系統，尤其涉及一種人血清白蛋白與白介素I受體拮抗劑融合蛋白的表達系統。
背景技術：
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是近些年來一個較為成功的外源蛋白真核表達系統，與大腸桿菌表達系統相比，它能更好地表達結構復雜的蛋白質，并且能夠完成如二硫鍵形成這樣的翻譯后修飾。與哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統相比，它具有操作簡單、表達量高、容易產業化放大等優勢。白介素 I 受體拮抗劑(Interleukin I receptor antagonist, ILlra),是一種可與ILl受體結合的蛋白，當其與ILl受體結合后可阻斷ILl的生物學活性。因此一定濃度的 ILlra能使這兩個細胞因子在生理學和病理生理學以及炎癥反應中的生物學活性被中和。2001年11月14日美國FDA正式公布批準美國Amgen公司生產的商品名為Kineret的重組(rh-) ILlra用于治療類風濕性關節炎，批準適應癥為“ 18歲以上的中度和嚴重的類風濕性關節炎患者，在使用一種或多種改善疾病的抗風濕藥物后失效時，明顯減輕病人的體征和癥狀”。由于ILlra分子量只有17kDa，易被腎小球濾過，因而在臨床治療時，血藥半衰期較短，一般需要大劑量頻繁用藥，如100mg/day。為了提高重組ILlra在體內的血藥時間，中國專利200810060568. 7利用基因工程手段將其與HSA融合后插入畢赤酵母中并表達，經融合后的蛋白(IGH)在小鼠體內血藥半衰期顯著提高，但該融合蛋白基因在畢赤酵母中為單拷貝，蛋白表達量不夠高。

發明內容
本發明提供了一種人血清白蛋白與白介素I受體拮抗劑融合蛋白的表達系統，以解決現有表達系統融合蛋白表達量不聞的問題。一種人血清白蛋白與白介素I受體拮抗劑融合蛋白的表達系統，包括宿主細胞和轉化入宿主細胞的表達載體，所述表達載體包括插入有融合蛋白基因的第一表達載體和插入有二硫鍵異構酶基因的第二表達載體，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素I受體拮抗劑基因，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。二硫鍵異構酶(PDI)是硫氧化還原酶家族中的一種，主要功能是在內質網上催化新合成的蛋白形成正確的二硫鍵。在畢赤酵母的內質網上有一套嚴格的質量控制體系，只有形成正確結構的蛋白才能從內質網分泌到高爾基體當中。如果蛋白沒有形成正確的結構，則會被降解或積聚在內質網上，最終降低該蛋白的表達。IGH融合蛋白中含有18對_■硫鍵，更多的PDI可以幫助融合蛋白形成正確的二硫鍵，以提高表達量。在第一表達載體中包含IGH融合蛋白基因為目的基因，它插入在啟動子的下游，在第二表達載體中包含二硫鍵異構酶基因為目的基因，它同樣插入在啟動子的下游。
在第一表達載體中，人血清白蛋白基因和白介素I受體拮抗劑基因可以直接連接，也可以通過連接肽序列連接，所述連接肽序列是指編碼連接肽的DNA序列，連接肽用于連接人血清白蛋白和白介素I受體拮抗劑。該連接肽的氨基酸殘基序列可以由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸中的一種或多種連接組成，具體可以為[GGGS]n，n為不大于4的自然數。在融合蛋白基因中，人血清白蛋白基因和白介素I受體拮抗劑基因兩者之間的相對位置是任意的。所述融合蛋白基因還包括限制性酶切位點，使得酶切后可以產生粘性末端，便于基因序列的連接。關于融合蛋白的基因結構可以參考中國專利200810060568. 7公開的內容。所述第一表達載體和第二表達載體為真核表達載體，優選的，所述第一表達載體包含信號肽，所述第二表達載體不包含信號肽，如此融合蛋白可以分泌到胞外，而PDI可以存留在胞內，便于融合蛋白的分離純化。更優選的，所述第一表達載體和第二表達載體的原始載體優選為PPIC系列載體，其中第一表達載體的原始載體優選為pPICZ α B，第二表達載體的原始載體優選為PPIC3. 5Κ。在本發明中第一表達載體可以為單拷貝，但為了提高表達量，最好選用為多拷貝，拷貝數至少為2個，優選為3 4個。 本發明還提供所述表達系統的構建方法，包括(a)用限制性內切酶將融合蛋白基因(IGH基因)從pPIC9_IGH上切下并回收；(b)將步驟(a)中得到的IGH基因插入到pPICZ α B相應的酶切位點中；(c)將步驟(b)中得到的pPICZ a B-IGH線性化后電轉到表達宿主GSl 15中，轉化了的細胞在含有Zeocin的平板上篩選單克隆；(d)鑒定步驟(C)中得到的單克隆菌株表達量及IGH基因拷貝數。(e)將二硫鍵異構酶(PDI 基因)插入 pPIC3. 5K，得到 pPIC3. 5K-PDI ；(f)將步驟(e)中得到的pPIC3. 5K-PDI載體用BspE I線性化后電轉化步驟(d)得到的含有pPICZ a B-IGH的GSl 15菌株，轉化后的細胞先涂布到RDB平皿，然后在含有O. 5或I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑選轉化子；(g)將步驟(f)中挑選到的轉化子在搖瓶條件下表達IGH蛋白，培養基上清用SDS-PAGE分析表達量。步驟(a)中，IGH基因即為本發明所述的融合蛋白基因，其堿基序列如SEQ IDNO. I所示，質粒PPIC9-IGH結構及其構建方法已在中國專利200810060568. 7中公開，切下的IGH基因上游序列含有Xho I酶切位點，下游含有Not I酶切位點。步驟(b)中，空質粒pPICZ α B首先用Xho I和Not I酶切，然后與IGH基因連接，得到pPICZ a B-IGH質粒。步驟(c)中，pPICZ a B-IGH質粒用Pme I線性化后電轉化GS 115表達宿主，轉化后的細胞涂布于含有100，700或1500μ g/mLZeocin的平板上篩選單克隆菌株。步驟(d)中，將步驟(C)中挑選的克隆在搖瓶條件下表達IGH蛋白，培養基上清用SDS-PAGE分析表達量，挑選的克隆中IGH基因的拷貝數用RT-PCR鑒定，可參考Norden等(Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporinsin Pichia pastoris, BMC biotechnology, 2011)公開的方法。步驟(e)中，PDI基因的堿基序列可以如SEQ ID NO. 2所示。
畢赤酵母GS 115、質粒 pPICZ α B 為商業化產品(Invitrogen Corp. San Diego.California. USA)。與現有技術相比較，本發明具有的有益效果為(I)畢赤酵母自身分泌到培養基中的蛋白很少，因此，高分泌的外源蛋白易從培養基中分離；另外與釀酒酵母相比，赤酵母不產生過度的糖基化，所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應用。(2)本發明構建PDI與IGH共表達的宿主，使得IGH的表達量顯著提高，由于HH在胞內表達，而IGH分泌表達到胞外，所以收集的培養基上清中IGH濃度增加的同時不會新產生其他蛋白。


圖I為重組質粒pPICZ a B-IGH的構建示意圖。

圖2為IGH融合蛋白在不同Zeocin濃度下挑選得到的克隆菌株的PAGE分析。a為SDS-PAGE電泳圖，其中L1-L5為100 μ g/mLZeocin的平板上篩選單克隆菌株，H1-H4為700 μ g/mLZeocin的平板上篩選單克隆菌株；b為所對應的菌株用蛋白定量軟件QuantityOne定量然后計算出單位菌體表達量比較(方差來自三個平行)。圖3為重組質粒pPIC3. 5K-PDI的示意圖。圖4 為導入了 PDI 或 BiP (immunoglobulin binding protein)基因的多拷貝 IGH宿主表達上清SDS-PAGE分析圖。a為SDS-PAGE電泳圖，其中I為IGH單拷貝菌株，2為步驟(c)得到的多IGH拷貝菌株，3為0. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑選的轉了 PDI的多IGH拷貝單克隆菌株，4，5為I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑選的轉了 PDI的多IGH拷貝單克隆菌株，6為0. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑選的轉了 BiP的多IGH拷貝單克隆菌株，7，8為I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑選的轉了 BiP的多IGH拷貝單克隆菌株。b為所對應的菌株用Biorad公司的蛋白定量軟件Quantity One定量然后計算出單位菌體表達量比較(方差來自三個平行)。圖5為Real Time PCR鑒定PDI是否被誘導結果圖。圖6為Real Time PCR鑒定BiP是否被誘導結果圖。
具體實施例方式實施例I構建質粒pPIC9-IGH，并獲得可表達IGH蛋白的DNA序列使用專利申請號200810060568. 7公開的質粒PGEM-T-HSA和PGEM-T-ILlra作為模板，根據ILlra基因和HSA基因的序列設計引物ILlra up (SEQ ID NO. 16) ,ILlra dn(SEQID NO. 17)、HSAup (SEQ ID NO. 18)和 HSA dn (SEQ ID NO. 19)進行 PCR 擴增。鑒于 BamH I酶切位點的堿基序列正好編碼-GS-，特將編碼連接肽-GGGGS-的密碼子設計在ILlra dn5’端，如此也設計入了 BamH I酶切位點。且在HSA up 5’端也添加BamHI酶切位點，如此可通過BamH I酶切、連接從而融合ILlra基因和HSA基因。將ILlra基因擴增產物用XhoI和BamH I酶切后回收，將HSA基因擴增產物用BamH I和EcoR I酶切后回收，將pPIC9空質粒用Xho I和EcoR I酶切后回收。將酶切后的ILlra基因、HSA基因和pPIC9基因三片段相連得到質粒PPIC9-IGH，其中IGH表達序列見SEQ ID NO. I。
用Xho I和Not I雙酶切質粒PPIC9-IGH，將含有IGH基因片段的酶切產物電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。實施例2重組質粒pPICZ a B-IGH構建將空pPICZ α B載體用Xho I和Not I酶切，電泳回收載體片段。將酶切后的pPICZ α B載體和實例I中得到的IGH表達序列以適當比例混合，用Τ4連接酶在16°C水浴中連接12小時，形成pPICZ aB_IGH(構建原理見圖I)。pPICZ a B-IGH轉化入DH5 α后，鋪于含25yg/mL Zeocin的LB瓊脂平皿，37°C培養過夜。挑選平皿上數個克隆接種5mL含25 μ g/mLZeocin的LB液體培養基中，37°C培養過夜。獲得的陽性克隆送上海生工測序驗證正確。實施例3重組質粒pPICZ a B-IGH轉化GSl 15將實例2中得到的驗證正確的pPICZ a B-IGH質粒用Pme I線性化后以電轉化的方式轉化入畢赤酵母GS115，轉化后的細胞在YPD液體培養基中30°C孵育2小時，然后涂布到含有 100, 700 或 1500 μ g/mL Zeocin 的 YPDS 瓊脂平皿(I % yeast extract, 2% peptone, 2%葡萄糖，IM山梨醇，2%瓊脂糖，IM山梨醇)。在30°C培養3天后，100，700或1500 μ g/mL Zeocin的YPDS瓊脂平皿上分別長出約200個，4個，O個單菌落。在100和700 μ g/mLZeocin的YPDS瓊脂平皿上分別挑取5個(命名為LI 5)和4個(命名為Hl 4)單菌落。實施例4融合蛋白IGH在多拷貝宿主中提高表達參考 Norden 等(Increasing gene dosage greatly enhances recombinantexpression of aquaporins in Pichia pastoris,BMC biotechnology,2011)公開的方法，用Real Time PCR確定實施例3中挑選的9個克隆IGH拷貝數，結果見表I。表I
權利要求
1.一種人血清白蛋白與白介素I受體拮抗劑融合蛋白的表達系統，包括宿主細胞和轉化入宿主細胞的表達載體，其特征在于，所述表達載體包括插入有融合蛋白基因的第一表達載體和插入有二硫鍵異構酶基因的第二表達載體，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素I受體拮抗劑基因，所述宿主細胞為畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
2.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述融合蛋白基因包括連接人血清白蛋白基因和白介素I受體措抗劑基因的連接妝序列。
3.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述融合蛋白基因的堿基序列如SEQID NO. I 所示。
4.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述的二硫鍵異構酶基因的堿基序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
5.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述第一表達載體和第二表達載體的原始載體均為PPIC系列載體。
6.如權利要求5所述的表達系統，其特征在于，所述第一表達載體包含信號肽，所述第二表達載體不包含信號肽。
7.如權利要求6所述的表達系統，其特征在于，所述第一表達載體的原始載體為pPICZa B。
8.如權利要求6所述的表達系統，其特征在于，所述第二表達載體的原始載體為pPIC3. 5K。
9.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述第一表達載體的拷貝數為3 4個。
10.如權利要求I所述的表達系統，其特征在于，所述第二表達載體的拷貝數為至少兩個。
全文摘要
本發明公開了一種人血清白蛋白與白介素1受體拮抗劑融合蛋白的表達系統，包括宿主細胞和轉化入宿主細胞的表達載體，所述表達載體包括插入有融合蛋白基因的第一表達載體和插入有二硫鍵異構酶基因的第二表達載體，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受體拮抗劑基因，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。本發明構建PDI與IGH共表達的宿主，使得IGH的表達量顯著提高，由于PDI在胞內表達，而IGH分泌表達到胞外，所以收集的培養基上清中IGH濃度增加的同時不會新產生其他蛋白。
文檔編號C12R1/84GK102766648SQ20121025970
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者沈其, 陳樞青 申請人:浙江大學