專利名稱：：一種豬圓環(huán)病毒ii型疫苗制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及動物病毒，更具體是涉及豬圓環(huán)病毒II型疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒II型(簡稱PCV2)感染引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(P麗S)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬皮膚和腎病綜合征(PDNS)等多種疾病(總稱為豬圓環(huán)病毒病，PCVDs)，其臨床特征為體重逐漸減輕，以及體征例如呼吸急促、呼吸困難和黃疸。從病理學觀點來看，其表現(xiàn)為淋巴細胞或肉芽腫浸潤，淋巴結(jié)病以及較罕見的肝炎和淋巴細胞或肉芽腫性腎炎。(ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499-501;LaSemaineVeterinaireNo.26，supplementtoLaSemaineVeterinaire1996(834);LaSemaineVeterinaire1997(857):54;Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387)。該病最早于1991年在力口拿大西部發(fā)現(xiàn)(ClarkEG.Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome.ProcAmAssocSwinePract，1997，28:499-501)，隨后，該疾病相繼在美國、法國、西班牙、北愛爾蘭等國或地區(qū)出現(xiàn)(DaftB等.Interstitialpneumoniaandl卿hade,hathyassociatedwithcircoviralinfectioninasixweek—oldpig.ProcAmAssocYetLabDiag，1996，39:32;Ke皿edyS等.PorcinecircovirusinfectioninNorthernIreland,vetRec，1998，142:495并96;LeCannP等.Pigletwastingdisease.TletRec，1997，141:660;SegalesJ等.Firstreportofpost-weaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsinSpain.VetRec，1997，141:600-660)。在國內(nèi)，郎洪武等(郎洪武等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測.中國獸醫(yī)科技，2000，30:3-5)和曹勝波等(曹勝波等.豬II型圓環(huán)病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析.病毒學報，2000，18:137-141)分別通過血清學和病原學調(diào)查表明，我國已有PCV2的流行。目前，PCV2已在世界各地廣泛存在并流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了相當大的經(jīng)濟損失。目前還沒有治療和預(yù)防這種疾病的方法。然而，多項證據(jù)指出豬圓環(huán)病毒是P麗S(斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)的病原體(Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51)。圓環(huán)病毒已從患有P麗S的豬回收，并且針對豬圓環(huán)病毒的抗體已在患有該疾病的豬體內(nèi)證實。由于該病毒是一種DNA病毒，病毒變異率低，同時在世界范圍內(nèi)的致病只有PCV2—型。而PCV2的生物學特性比較特殊，它在細胞上增殖滴度很低，而且不引起細胞病變，因此研制PCV2的滅活疫苗和弱毒疫苗的難度很大。目前國內(nèi)外生產(chǎn)疫苗主要有兩種工藝(l)生物反應(yīng)器規(guī)模較小，一般是實驗室用，不能規(guī)模化生產(chǎn)；其有攪拌漿，以載體為依托培養(yǎng)細胞。這種方法的缺點是攪拌產(chǎn)生剪切力，并且有氣泡生成，影響細胞生長，規(guī)模化生產(chǎn)存在技術(shù)瓶頸。(2)轉(zhuǎn)瓶技術(shù)目前工業(yè)化生產(chǎn)基本都采用這種技術(shù)，生產(chǎn)細胞和病毒時勞動強度大、占地大、批間差異大、生產(chǎn)成本高、單批產(chǎn)量低，難以進行標準化生產(chǎn)的質(zhì)量控制。在我國還未有確實有效并經(jīng)過農(nóng)業(yè)部批準的PCV2疫苗，主要原因還在于，抗原濃度較低，PCV2在細胞中的生長滴度較低，一般僅為10"TCIDs。/ml左右。因此提高病毒效價和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，是解決豬圓環(huán)病毒II型疫苗產(chǎn)業(yè)化的難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種圓環(huán)病毒II型(PCV2)疫苗的制備方法。該方法生產(chǎn)工藝簡單、易操作，所得產(chǎn)品病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控制，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。本發(fā)明方法包括下列操作步驟(1)將制苗用宿主細胞接種到含有細胞生長用培養(yǎng)液與微載體的載體罐內(nèi)，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細胞生長足夠的養(yǎng)分及氣體環(huán)境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的540倍；(2)將細胞生長液更換為維持用培養(yǎng)液，并同步加入豬圓環(huán)病毒II型種毒，先使其吸附在細胞上，然后進行培養(yǎng)，增殖病毒；(3)培養(yǎng)24小時后將細胞維持液棄去，接種病毒的細胞用0.01mol/L的PBS充分洗滌，加入D-氨基葡萄糖孵育30min;(4)棄去D-氨基葡萄糖，將細胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗滌，加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細胞；(5)連續(xù)培養(yǎng)10天后，收獲病毒液，于_20°〇凍融兩次，得到豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)病毒液;(6)病毒液經(jīng)檢驗合格后，加入甲醛滅活，滅活后的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)加入常規(guī)油性佐劑或雙相佐劑，攪拌混勻，制得油乳劑疫苗或雙相疫苗。制苗毒液的檢驗方法制苗毒液按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關(guān)規(guī)定進行檢驗，完全符合，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。通過IFA法測定病毒的效價，細胞制苗毒液每1.Oml含病毒^106°TCID5。；成品檢驗方法按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關(guān)規(guī)定進行檢驗，完全符合，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。上述技術(shù)方案中，所述的宿主細胞為可增殖豬圓環(huán)病毒病毒II型(PCV2)的細胞系，如PK15細胞系等。上述技術(shù)方案中，所述的載體為網(wǎng)狀纖維，如聚酯纖維。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中所述微載體用量為每500ml培養(yǎng)液添加5.5g微載體、細胞的初始接種量為1.42.6X107Cells/g微載體較好。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述接種病毒時細胞密度為1.12.0X108cellS/g微載體。上述技術(shù)方案中，細胞培養(yǎng)的環(huán)境為溫度37t:，0)2濃度為5X，培養(yǎng)液pH值為7.0-7.6。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述接種病毒時按病毒感染復數(shù)(M.O.I.)為0.011的比例。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中所述細胞培養(yǎng)時一般貼附4h后開始培養(yǎng)程序。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述接種病毒時一般吸附4h后開始病毒培養(yǎng)程序。本發(fā)明方法中培養(yǎng)細胞和病毒，可在生物反應(yīng)器中進行。生物反應(yīng)器主要包括載體瓶、儲液罐、PH控制器、D0監(jiān)測器、輸入和輸出系統(tǒng)。工作過程如下細胞貼附在載體瓶中載體上生長，當儲液罐的培養(yǎng)液被泵入載體瓶時，培養(yǎng)液液面上升向細胞供給養(yǎng)分并促進細胞新陳代謝產(chǎn)物的去除；當載體瓶的培養(yǎng)液泵入儲液罐時，培養(yǎng)液面隨之下降，使細胞進行通風，促進呼吸，減小細胞切向壓力，無02供應(yīng)限制，無泡沫煩惱。這個重復的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養(yǎng)和02，同時產(chǎn)生的代謝廢物像C02能夠有效的被排出去，從而能夠大量的擴增細胞并增值病毒，此種技術(shù)稱之為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)疫苗的方法，具有以下有益效果(1)毒價高傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)的PCV2病毒效價僅為10"TCIDs。/ml，而本發(fā)明采用新的技術(shù)參數(shù)，運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)生產(chǎn)的病毒效價可以達到106°TCID50/ml1()70TCID5o/ml，其毒價要高出100-1000倍。(2)生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高目前國內(nèi)采用攪拌式懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)動物細胞，單臺生物反應(yīng)器最大規(guī)模不超過IOOL;而本發(fā)明采用新的技術(shù)參數(shù)，運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)動物細胞，單臺生物反應(yīng)器規(guī)模達500L，最大可達IOOOL，單臺規(guī)模提高5-10倍。(3)生產(chǎn)成本相對較低、產(chǎn)品質(zhì)量高且穩(wěn)定傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的PCV2病毒效價僅為10"TCID5。/ml，要達到獸用生物制品規(guī)程要求的10，CID5。/ml，需要進行濃縮處理，每ml的生產(chǎn)成本為3元，而本發(fā)明工藝生產(chǎn)的PCV2病毒效價可達10"TCIDs。/ml，每ml的生產(chǎn)成本為0.5元，產(chǎn)品成本下降6倍，質(zhì)量提高提高100倍(以毒價計)。(4)操作方便、操作空間小500L工作體積僅需20m2的操作區(qū)域，僅需2人就可完成全部操作，而傳統(tǒng)工藝需要2000個大方瓶或轉(zhuǎn)瓶，最少需要600m2的操作區(qū)域，最少需要100人才能完成。(5)工藝參數(shù)控制精確本發(fā)明運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)時可控參數(shù)有溫度、pH值、溶氧量、二氧化碳濃度、載體濃度，可實現(xiàn)在線監(jiān)測的參數(shù)有葡萄糖、乳酸和銨離子濃度，批次質(zhì)量穩(wěn)定，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異大。(6)本發(fā)明利用生物反應(yīng)器，解決抗原濃度低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大的問題，而且能連續(xù)培養(yǎng)、占地小、生產(chǎn)規(guī)模大、無攪拌式懸浮培養(yǎng)時對細胞形成的剪切力、無氣泡產(chǎn)生、對細胞無傷害。具體實施例方式實施例1潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)PK15細胞及豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)所使用的生物反應(yīng)器為美國CESC0公司的TideCell-020，所使用的載體為美國CESCO公司的BioNocII聚酯纖維。(1)將PK15細胞4.0X10、ell接種于20L載體罐中并添加載體BioNocII聚酯纖維2.2X102g，以及工作體積為500L的含6%小牛血清的DMEM生長用培養(yǎng)液，潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)至細胞總數(shù)達到4.OXl(Tcell;培養(yǎng)細胞時先啟動貼附程序，4h后換成5培養(yǎng)程序；細胞貼附程序為卯2500mL/minholdlmin、Down:2500mL/minhold30s、設(shè)定最大換液量18500mL;細胞培養(yǎng)程序up:1900mL/minholdlmin、Down1900mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量18000mL;(2)將細胞生長用培養(yǎng)液全部更換為含2X小牛血清的維持用DMEM培養(yǎng)液，并同步(M.O.I.=0.1)加入豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)種毒，于37t:培養(yǎng)，控制二氧化碳濃度5%，pH值7.2;接種病毒時先啟動病毒吸附程序，4h后換成病毒培養(yǎng)程序；病毒吸附程序為up:1600mL/minholdlmin、Down:1600mL/minhold30s、設(shè)定最大換液量18500mL;病毒培養(yǎng)程序up:1000mL/minholdlmin、Down1000mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量18000mL;(3)培養(yǎng)24小時后將載體罐內(nèi)維持液棄去，細胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗滌，加入300mmol/LD_氨基葡萄糖孵育30分鐘(D_氨基葡萄糖添加量以剛好淹沒載體為準，孵育期間設(shè)備程序暫停，靜止孵育)；(4)棄去D-氨基葡萄糖將細胞用0.Olmol/L的PBS(pH7.4)充分洗滌以除去載體上殘留的D-氨基葡萄糖，加滿細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細胞；(5)連續(xù)培養(yǎng)10天后收獲病毒液，于_201:凍融兩次，即得到豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)。將收獲的病毒液進行半成品檢驗以確認符合各項標準；半成品檢驗(a)純凈性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關(guān)規(guī)定進行檢驗，結(jié)果無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(b)病毒含量測定將病毒用含300mmol/LD_氨基葡萄糖和2%小牛血清細胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從10—1到10—6。每個稀釋度接種8個L同時設(shè)立陰性不接毒對照，放入5%0)2溫箱中37t:培養(yǎng)4872h，80X丙酮固定，用免疫熒光抗體(IFA)方法測定每個稀釋度含有PCV2陽性細胞(綠色熒光)的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCIDs。，每1.Oml含病毒^106°TCID5。；(c)特異性用間接免疫熒光抗體(IFA)方法測定。將病毒接種于96孔細胞板PK15細胞，每個樣品4孑L每孔200iiL，同時設(shè)立陰性對照，放入5%C02溫箱中37。C培養(yǎng)4872h;棄去生長液，用O.01mol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌細胞2次，然后加入100yL預(yù)冷的80%丙酮溶液，41:固定30min。然后用PBS洗滌3次；棄掉維持液，PBS洗滌3次后，每孔加入100iiL用PBSl:100稀釋的豬抗PCV2血清，37t:作用lh;用PBS洗滌3次，每次3min后；加入用PBS1:100稀釋的熒光標記的兔抗豬IgG的二抗(IgG-FITC)，每孔100iiL，37t:作用lh;用PBS洗滌3次，每次3min，在熒光顯微鏡下觀察。細胞對照孔應(yīng)無特異性熒光出現(xiàn)，而病毒接種細胞孔應(yīng)有大量特異性熒光出現(xiàn)。實施例2豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)滅活疫苗的制備及免疫效力評價1.材料與方法1.1疫苗實施例1得到的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)病毒液按1:1比例加入206佐劑(法國SEPPIC公司產(chǎn)品)，充分混合均勻即得(批號為:0803、0804、0805、0806和0807)。將制得的疫苗進行成品檢驗以確認符合各項標準；6性狀檢驗本苗為水包油包水雙相淡紅色乳劑，性狀檢驗均達到了"質(zhì)量標準(草案)"的規(guī)定。取一個清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均不擴散。穩(wěn)定性檢驗在37t:條件下放置21日均不分層、不破乳。取疫苗10ml裝于離心管中，以3000r/min離心15min，管底未見水相析出。粘度檢驗用lml吸管(出口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)，吸取25。C左右疫苗1.Oml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，均在5s以內(nèi)。純凈性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關(guān)規(guī)定進行檢驗，結(jié)果無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。甲醛殘留量測定按照《中華人民共和國獸藥典》2005年版進行甲醛殘留量測定，結(jié)果甲醛含量均符合獸用生物制品通則的有關(guān)規(guī)定。1.2.試驗動物725周齡PCV2ELISA抗體和PCV2抗原陰性仔豬，購自河南洛陽。1.3.安全性試驗1.3.1.最小免疫日齡仔豬一次單劑量接種取7日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第15組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量2ml/頭；第6組為空白對照組，編號并稱體重后隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無臨床癥狀。接種后17天每天測量體溫(直腸溫度)。5批疫苗接種的仔豬和對照組豬均無臨床異常反應(yīng)，體溫正常。免疫后30天稱重，試驗組仔豬體重與對照組仔豬體重無差異(P>0.5)。1.3.2.仔豬單劑量重復接種取1518日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第15組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量2ml/頭，接種后2周，再用相同劑量免疫一次；第6組為空白對照組。編號并稱體重后隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無臨床癥狀。接種后17天每天測量體溫(直腸溫度)，試驗結(jié)束時稱體重。5批疫苗接種的仔豬和對照組豬均無臨床異常反應(yīng)，體溫正常。第二次免疫后30天稱重，試驗組仔豬體重與對照組仔豬體重無差異(P>0.5)。1.3.3.仔豬一次超劑量接種取25日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第15組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量4ml/頭；第6組為空白對照組，編號并稱體重后隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無臨床癥狀。接種后17天每天測量體溫(直腸溫度)，試驗結(jié)束時稱體重。5批疫苗2倍劑量接種的仔豬和對照組豬均無臨床異常反應(yīng)，體溫正常。免疫后30天稱重，試驗組仔豬體重與對照組仔豬體重無差異(P>0.5)。1.4.抗體檢測與攻毒保護試驗選擇35頭1518日齡PCV2ELISA抗體和PCV2抗原陰性斷奶仔豬，隨機分成7組，5頭/組，第1、2、3、4、5組免疫0803、0804、0805、0806和0807批滅活苗，頸部肌肉注射免疫，2ml/頭，兩周后用相同免疫劑量加強免疫一次；第6組為攻毒對照組；第7組為空白對照組，只接種鑰匙孔血藍蛋白(KLH/ICFA)和巰基乙酸培養(yǎng)基。二免后3周用PCV2-SH病毒攻擊，肌肉注射3X105°TCID5。/頭，攻毒后第4、7天分別在豬的兩腋下及兩臀部分四點接種用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/mL)，4mL/頭，腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，10mL/頭；攻毒后第11、19天僅腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，10mL/頭。檢測指標(l)分別于首免后14、21、35天采血，測定ELISA抗體和中和抗體效價，觀察抗體產(chǎn)生動態(tài)。(2)攻毒后120天測量體溫，觀察臨床癥狀。(3)死亡豬進行病理解剖，并且試驗結(jié)束時，撲殺所有豬，觀察病理變化。1.5.ELISA抗體檢測用大腸桿菌表達的PCV2-0RF2蛋白作為抗原，通過方陣滴定試驗確定抗原的最佳包被濃度。將抗原稀釋到最佳包被濃度后包被酶標板，iooiil/孔，37t:作用2h后4t:包被過夜；洗滌3次，每次3-5min;每孔加200yL的0.15%BSA封閉液封閉板子，37。C作用2h;洗滌；將待檢血清用PBS倍比稀釋，每個樣品一行，每孔加100iiL，37t:作用lh;洗滌；然后加入酶標的SPA(l:10000倍稀釋)，100iiL/孔，37。C作用lh;洗滌；加底物液TMB(3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺)顯色，最后用2mmol/L的H^04終止反應(yīng)。結(jié)果判定待檢血清0D45。值/陰性血清0D45。值>2.1為陽性。1.6.血清中和試驗采用固定病毒稀釋血清法。待檢血清56t:加熱30min，10000rpm離心5min，小心吸出上清，做1:2稀釋后進行倍比稀釋；分別與等量1000TCID5。PCV2-SH病毒液混合，37°Clh，接種于含PK15細胞單層的96孔板內(nèi)，100y1/孔，每一稀釋度接種4孔，同時設(shè)細胞對照和病毒對照孔。37t:培養(yǎng)12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖處理，37。C繼續(xù)培養(yǎng)48小時，80%丙酮固定細胞，用間接免疫熒光法測定每個稀釋度含有熒光的孔數(shù)。以能夠抑制50%特異性熒光細胞數(shù)的細胞孔的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價，并計算每組平均值。1.7.病理學檢查按常規(guī)方法進行病理解剖，觀察臟器病理變化，并采集肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器4%福爾馬林固定后，制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察組織病變。2.結(jié)果2.1.疫苗安全性5批疫苗分別做最小日齡仔豬一次單劑量接種以及仔豬單劑量重復接種和仔豬一次超劑量接種后均表現(xiàn)發(fā)育良好，精神狀態(tài)、食欲正常，無體溫升高和其他不良反應(yīng)。證明該疫苗安全性良好。結(jié)果見表13。表l7日齡仔豬一次單劑量接種安全性試驗結(jié)果8臨床_平均體溫('C)_平均體重(kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3仔豬一次超劑量接種安全性試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.2.免疫豬PCV2抗體檢測免疫后14天，免疫組均能檢測到PCV2抗體；首免疫后35天，疫苗免疫組ELISA抗體和中和抗體效價分別達l:3200和l:32以上，而且，ELISA抗體和中和抗體水平基本一致。結(jié)果見表4。表4仔豬攻毒保護試驗抗體檢測結(jié)果首免后不同時間ELISA抗體平均值中和抗體平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.3.攻毒保護試驗2.3.1.臨床癥狀攻毒對照組所有豬攻毒后第13周體溫升高(>40°C)，持續(xù)36天，攻毒后第10天出現(xiàn)被毛粗亂、食欲減退現(xiàn)象，第11天有1頭死亡；空白對照豬在整個攻毒期中體溫始終保持正常，無異常臨床表現(xiàn)。0803、0804、0805、0806和0807批疫苗免疫的豬，攻毒后第1周均有23頭豬出現(xiàn)體溫超過4(TC，持續(xù)12天，但均未見到明顯異常臨床表現(xiàn)。5批疫苗保護效率分別100%、100%、100%、100%和100%。結(jié)果見表5。2.3.2.體重變化為了評價疫苗對豬體的保護效果，我們分別在攻毒前及宰殺時對豬體進行稱重，計算豬的平均日增重。疫苗免疫組和空白對照組的相對日增重分別為0.0255、0.0250、0.0267、0.0245、0.0264和0.0268kg，表明疫苗免疫組豬相對日增重與空白對照組相似，但明顯高于非免疫攻毒對照組(P<0.05)。證明疫苗均有較好免疫保護作用。2.3.3.病理變化攻毒后第11天，攻毒對照豬1頭死亡，病理剖解表現(xiàn)為肺臟出血、彈性變低，腹股溝、髂下、頜下、腸系膜淋巴結(jié)腫脹、出血，脾臟邊緣輕微出血等。試驗結(jié)束時，撲殺所有試驗豬，進行病理解剖和組織病理學檢查。試驗結(jié)果表明非免疫攻毒對照組豬有明顯肉眼病理變化，淋巴結(jié)組織中淋巴細胞缺失、巨噬細胞浸潤、包涵體病變；肺臟組織有單核細胞浸潤；而免疫豬病理變化很不明顯。結(jié)果見表6。表5攻毒后20天內(nèi)豬臨床癥狀統(tǒng)計結(jié)果組別臨床癥狀攻毒后體溫》40'C的天數(shù)攻毒后體溫》發(fā)病否4(TC的頭數(shù)保護率(%)疫苗0803正常053_100%疫苗0804正常023_100%疫苗0805正常052_100%疫苗0806正常033-100%'疫苗0807IE常022_薩o攻毒對照組異常※365+空白對照組正常00_※被毛粗亂，皮膚蒼白，食欲減退，有死亡現(xiàn)象。表6攻毒豬病理變化統(tǒng)計結(jié)果11病理變化組別肺實變等淋巴結(jié)腫大腎有壞死點脾輕度腫大腸道鼓氣等疫苗08032/51/50/50/51/5疫苗08041/50/50/50/50/5疫苗08052/51/50/50/51/5疫苗08061/50/50/50/50/5疫苗08071/50/50/50/50/5攻毒對照組5/55/54/53/54/5空白對照組0/50/50/50/50/53.另外，比較以本發(fā)明"大規(guī)模潮汐式細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)"與常用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)PK15細胞，以增殖豬圓環(huán)病毒，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒相關(guān)比較如表7所示。表7不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖豬圓環(huán)病毒的相關(guān)比較培養(yǎng)方式TideCell-020懸浮培養(yǎng)3000ml轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)細胞貼壁面積528000cm21250cm2產(chǎn)量比值5l個微載體培養(yǎng)系統(tǒng)423個轉(zhuǎn)瓶占地面積20m2150m2人工投入2個人x4h30個人x8h風險暴露點<20個423個耗材成本低.高清洗成本低高收獲病毒液500L423><300ml=126.9L病毒毒價1065TCID50/ml1045TCID5o/ml操作工藝全自動微電腦控制程序繁瑣備注BioNOCII載體貼壁面積lg=2400cm2，1個TideCell-020微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)需要加入BioNOCII載體220g。124.結(jié)論本研究用5批豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗接種仔豬，結(jié)果均無異常臨床表現(xiàn)，安全性很好；仔豬免疫后14天產(chǎn)生ELISA抗體和中和抗體，首免后35天攻毒，無異常臨床表現(xiàn)和病理變化，免疫保護效率達100%，免疫效果良好。且以本發(fā)明采用新的工藝參數(shù)運用潮汐式微載體細胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗無論是抗原含量、產(chǎn)量還是生產(chǎn)成本等指標，遠優(yōu)于常用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)。權(quán)利要求一種豬圓環(huán)病毒II型疫苗制備方法，包括下列操作步驟(1)將制苗用宿主細胞接種到含有生長用培養(yǎng)液與微載體的載體罐內(nèi)，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細胞生長足夠的養(yǎng)分及氣體環(huán)境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；(2)將細胞生長用培養(yǎng)液更換為維持用培養(yǎng)液，并同步加入豬圓環(huán)病毒II型種毒，先使其吸附在細胞上，然后進行培養(yǎng)，增殖病毒；(3)培養(yǎng)24小時后將細胞維持液棄去，接種病毒的細胞以0.01mol/L的PBS充分洗滌，加入D-氨基葡萄糖孵育30min；(4)棄去D-氨基葡萄糖，將細胞以0.01mol/L、pH為7.4的PBS充分洗滌，加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細胞；(5)連續(xù)培養(yǎng)10天后，收獲病毒液，于-20℃凍融兩次，得到豬圓環(huán)病毒II型病毒液；(6)病毒液經(jīng)檢驗合格后，加入甲醛滅活，滅活后的豬圓環(huán)病毒II型加入常規(guī)油性佐劑或雙相佐劑，攪拌混勻，制得油乳劑疫苗或雙相疫苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主細胞為可增殖豬圓環(huán)病毒病毒II型的細胞系。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于細胞、病毒的增殖方法采用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)方式。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)、(2)中培養(yǎng)細胞時啟動貼附程序4h后換成培養(yǎng)程序，細胞貼附程序參數(shù)為up:23002700mL/minhold4075s、Down:23002700mL/minhold3060s、設(shè)定最大換液量18500ml;細胞培養(yǎng)程序參數(shù)為up:17002100mL/minhold4075s、Downl7002100mL/minhold4075s、設(shè)定最大換液量18000ml。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于接種病毒時啟動病毒吸附程序4h后換成病毒增殖程序，病毒吸附程序參數(shù)為卯14001800mL/minhold4075s、Down:14001800mL/minhold3060s、設(shè)定最大換液量18500ml;病毒增殖程序參數(shù)為up:9001200mL/minhold4075s、Down9001200mL/minhold4075s、設(shè)定最大換液量18000ml。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的微載體為聚酯纖維。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述微載體用量為每500ml培養(yǎng)液添加5.5g微載體，細胞的初始接種量為1.42.6Xl()7cells/g微載體。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于細胞培養(yǎng)的環(huán)境為溫度37t:，0)2濃度為5%，培養(yǎng)液pH值為7.07.6。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述接種病毒時細胞密度為1.12.OX108cells/g微載體。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述接種病毒時按病毒感染復數(shù)為0.011的比例。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)滅活疫苗大規(guī)模生產(chǎn)及其制備方法，包括如下技術(shù)步驟(1)制苗用細胞高密度培養(yǎng)；(2)制苗毒液的繁殖；(3)加入佐劑制備滅活疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有病毒產(chǎn)量高、毒價高、生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對較低、產(chǎn)品質(zhì)量高且穩(wěn)定、操作方便、操作空間小、工藝參數(shù)控制精確等優(yōu)點。本發(fā)明滅活疫苗具有較好安全性，并可以誘導豬體產(chǎn)生免疫保護效果，完全符合國家生物制品標準。文檔編號C12N7/00GK101773667SQ20101010203公開日2010年7月14日申請日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者喬榮岑,習向鋒,孫進忠,張海洋,張許科,彭伍平,李三,陶家權(quán)申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司