專利名稱：一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域或獸醫生物制品領域，具體是一種對豬體 核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序。
2背景技術：
近年來由于分子生物學的發展，使得疫苗學進入了一個嶄新的分子免疫時 代，其標志是各種分子免疫增強劑的研究和應用。如何進一步提高傳統疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增強劑的應用，能全面提高機體的整體免疫 水平，增強抗病防御和免疫應答能力，提高疫苗保護率。其中，CpG基序(CpG寡聚 脫氧核苷酸)的研究是其中的焦點。CpG序列已被證實能作為疫苗的高效免疫增 強劑，使用得當能夠大幅度提高疫苗的免疫保護率和機體的免疫水平。近來大量 免疫學研究證實含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(l)誘導B細胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗誘生的細胞凋亡；(3)誘導單核細胞 分泌IL-12及其他細胞因子；(4)活化自然殺傷(NK)細胞的裂解活性和干擾素 (IFN-Y)分泌。
使用CpG寡核苷酸作佐劑要面臨的一個較復雜的問題就是對于不同的物種 其最佳的CpG序列不同，比如對鼠免疫刺激效果最好的序列是5' -GACGTT-3'
(Zina et al, 1998)，對人的刺激作用最強的是5， -GTCGTT-3，。目前開發 CpG佐劑要解決的問題是確定不同的DNA疫苗所需要的含CpG寡核苷酸的最合適 的劑量以及對不同物種具有特異性的寡核苷酸序列。
我國是世界養豬大國，2002年以來生豬飼養量在11億頭以上，在畜牧業生 產中占有較大的比重，同時養豬業也是我國部分省區的主要生產支柱和新的經 濟增長點。但面對當前養豬業重大疫病發生和流行愈加復雜的形勢——舊病未 除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學理論和生產技術來 發展豬用安全、高效疫苗預防和控制各種疫病的發生和流行，而免疫增強劑的 研制是疫苗研究的主要組成部分。
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發明內容
本發明提供一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，可使DNA疫苗產生更有效的免疫反應。
本發明的目的是通過以下方式實現的人工合成一種CpG基序，其引物序 列如下
7-A: CTCAT^ATCCTAT，TCCTAT^ATCCTAT靜TCCTAT，TCCTAT^ATGGGCC 7-B: CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC 注a、加黑部分需硫代修飾
CpG基序的免疫增強作用檢驗步驟如下
1 )選擇15頭健康豬(長白X大白二元雜交)，120日齡左右，體重90 —115kg，
經檢疫，健康狀況良好。
2)外周血淋巴細胞的分離培養
采集肝素抗凝血，用PBS(ra7.4)稀釋液l: l稀釋，小心疊加于2倍體積孵 育至室溫的淋巴細胞分離液上，以1500rpm水平離心25min。將收集血漿層與淋 巴細胞分離液層之間的淋巴細胞層，放入含PBS(ra7. 4)洗滌液5ml的試管中， 充分混勻后，以1000rpm離心10min。棄上清液沉淀用5mlPBS(PH7. 4)洗滌液以 1000rpm離心10min洗兩次，所得即是淋巴細胞。細胞沉淀用5ml含10%犢牛血 清的RPMI1640營養液懸浮。進行活力檢測與計數。 3)脾臟免疫細胞的分離
取豬脾臟，剪碎，然后用研磨器勻漿。勻漿液經150目銅網過濾，濾液經 2000rpm離心10 min收集細胞泥。用2ml紅細胞裂解液懸浮，室溫處理5min， 然后用10ml GKN溶液中和混勻后2000rpm離心10min。將細胞沉淀用PBS離心 洗滌3-4次，至細胞沉淀純白色。細胞沉淀用5ml含10%犢牛血清的RPMI1640 營養液懸浮，進行活力檢測與計數。
4) 活力檢測與計數
取10ul細胞懸液加90 1%的臺盼藍溶液，混勻，滴加到血球計數板上， 進行淋巴細胞活力檢測及計數。用1(m犢牛血清的RPMI1640細胞營養液調整至 2Xl()7細胞/ml。
5) 外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞增殖試驗(MTT法)
將96孔細胞培養板分成12組，每組三孔；將懸浮細胞的細胞培養液加入 細胞培養板(從第一組至陰性對照，每組三個重復，每孔150pL);空白對照孔 加入150^iL無細胞的細胞培養液(三個重復)；將CpG-0DN(100^ig/mL)樣品分 別加入第1組至第9組(每組三個重復，每孔lOpL);陽性對照加入ConA(100iiig/mL)(三個重復，每孔lOpL);空白對照加入細胞培養液(三個重復，每孔10|lL); 將細胞培養板放入置37°C， C02培養箱中培養48h，每孔加入10ulMTT(5pg/|LiU ， 繼續培養4h。然后每孔加入100^iL的DMS0，使紫黑色結晶完全溶解，測定0049。 的值。同時設不加細胞的營養液對照。以待測樣品0D，減去培養液對照孔0D49。， 即為試驗孔A值；以刺激指數(SI)作為判斷淋巴細胞轉化程度的參數。應用方 差分析進行差異顯著性檢驗。 6)數據處理
以刺激指數(SI)作為判斷淋巴細胞轉化程度的參數。SI大于2具有刺激 效果。應用公式計算如下
SI二( ODs - ODb)/( ODn - ODb) ODs:樣品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:陰性(negative)孔OD值。 實驗數據采用SPSS軟件對所測的SI值進行方差分析多重比較。 本發明CpG基序作為免疫增強劑的優越性對淋巴細胞增殖能力和對豬脾 臟免疫細胞的刺激作用較好，可以用作核酸疫苗的佐劑進一步提高核酸疫苗的 免疫效果；易規?；a，成本低廉，易于保存和運輸；安全性好。細胞因子 是機體內本身存在的免疫調節分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調 節網絡的控制；易于構建和改造，利用分子生物學技術在基因水平可實現人們 所期望的免疫應答強度和類型。SEQUENCE LISTING
〈110>.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
〈120〉 一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 59
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈222〉 (6， 15， 24， 33， 42， 51) 〈223> s2c
<400> 1
ctcatcgatc ctatcgatcc tatcgatcct atcgatccta tcgatcctat cgatgggcc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA <213>人工序列
<220>
〈222〉 (4， 13， 22， 31, 40， 49) 〈223〉 s2c
〈400〉 2
catcgatagg atcgatagga tcgataggat cgataggatc gataggatcg atgagggcc 59
權利要求
1、一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，用于其合成的引物序列為7-ACTCAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATGGGCC7-BCATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC。
2、 一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序，其免疫增強作用的檢測步驟如下1) 選擇120日齡健康豬15頭為原料備用；2) 外周血淋巴細胞的分離培養；3) 脾臟免疫細胞的分離；4) 活力檢測與計數；5) 外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞增殖試驗，即MTT法；步驟如下a將96孔細胞培養板分成12組，每組三孔；將懸浮細胞的細胞培養液加入 細胞培養板，從第一組至陰性對照，每組三個重復，每孔150(aL; b空白對照孔加入150pL無細胞的細胞培養液，三個重復； c將CpG基序調整為100pg/mL，樣品分別加入第1組至第9組，每組三個 重復，每孔10iiL;d陽性對照加入ConA 100pg/ mL，三個重復，每孔lOpL;空白對照加入細 胞培養液，三個重復，每孔10iiiL;e將細胞培養板放入置37°C， C02培養箱中培養48h，每孔加入10ulMTT， 5pgAiL，繼續培養4h，然后每孔加入100)LiL的DMS0，使紫黑色結晶完全溶解， 測定OD，的值，同時設不加細胞的營養液對照，以待測樣品0D49。減去培養液對 照孔0D49。，即為試驗孔A值；以刺激指數"SI"作為判斷淋巴細胞轉化程度的 參數，應用方差分析進行差異顯著性檢驗；6) 數據處理以刺激指數(SI)作為判斷淋巴細胞轉化程度的參數，SI大于2具有刺激 效果，應用公式計算如下SI=( ODs - 0Db)/( ODn - ODb) ODs:樣品(samole)孔OD值； ODb:空白(blank)孔OD值； ODn:陰性(negative)孔0D值。
全文摘要
本發明提供一種對豬體核酸疫苗具有免疫增強作用的CpG基序。人工合成系列CpG基序免疫豬體，通過測定其細胞免疫水平和體液免疫水平確定了一種對豬最適的CpG基序，該CpG基序可以用作核酸疫苗的佐劑進一步提高核酸疫苗的免疫效果。本發明CpG基序作為免疫增強劑的優越性制備方法簡單，易于保存和運輸；質量易于控制，易規模化生產，成本低廉，易于保存和運輸；安全性好。細胞因子是機體內本身存在的免疫調節分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調節網絡的控制；易于構建和改造，利用分子生物學技術在基因水平可實現人們所期望的免疫應答強度和類型。
文檔編號A61K39/39GK101423832SQ200810014059
公開日2009年5月6日 申請日期2008年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者任慧英, 吳家強, 順 周, 張秀美, 朱新產, 俊 李, 溫建新, 王金寶 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所