專利名稱：具有促生作用的鐵皮石斛內(nèi)生菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然藥用植物內(nèi)生細菌一鐵皮石斛內(nèi)生菌及其用途。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛屬蘭科(Orchidaceae)植物中的第二大屬——石斛屬(Dendrobium Sff.)，是石斛中的極品，屬氣生蘭科草本植物，它因表皮呈鐵綠色而得名，具有滋陰清熱、生 津益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮(zhèn)痛消炎等功效；現(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗 衰老、增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用。由于其極大的藥用價值，使其成 為全國涉及用到石斛類的制藥廠和保健品加工企業(yè)原料命脈。但鐵皮石斛的生長條件十分 苛刻，因此自然產(chǎn)量極為稀少，更因民間長期過度采挖，致使野生資源瀕臨絕種。據(jù)統(tǒng)計我國每年用石斛為原料的藥品、保健品產(chǎn)值超過幾百億元，市場需求的數(shù) 量每年均在幾百萬公斤以上，而且逐年呈上升趨勢。目前市場上生產(chǎn)的鐵皮石斛大部分都 來自人工培育，即先經(jīng)過組培的方式擴繁鐵皮石斛，再經(jīng)煉苗移栽田間。然而人工培育鐵皮 石斛仍存在繁殖育苗難、移栽成活難和生長緩慢三大難題，這無疑是對鐵皮石斛的開發(fā)利 用的一個嚴重的阻礙。植物內(nèi)生菌是能從經(jīng)過表面消毒的植物組織中分離或者從植物內(nèi)部的汁液中獲 得，并且對植物表觀上無危害即不導致明顯病癥的微生物。植物內(nèi)生菌包括互惠共利的 (mutualistic)和中性的(neutral)內(nèi)共生微生物。目前已經(jīng)從很多植物的各種器官(根、莖、葉、花、果實、種子)中分離到內(nèi)生菌。它 們在植物體內(nèi)的普遍性、豐富的生物多樣性及功能多樣性方面已有不少文獻報道。內(nèi)生菌 經(jīng)過長期的與植物發(fā)生相互作用，它們之間形成較復雜的關(guān)系。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對宿主植 物有以下幾個方面的作用(1)促進宿主植物生長，提高宿主的生產(chǎn)力，可增強宿主對病、蟲的抗性，因而在農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)、生物控制和生物防治方面有著重要意義；(2)、增強宿主植物對環(huán)境脅迫的抗性。如對干旱、全球氣溫上升、鹽堿、重金屬及 其它有毒物質(zhì)污染等的抗性；(3)、內(nèi)生菌產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)。植物內(nèi)生菌作為一種特殊生境下的微生物， 在植物體內(nèi)能產(chǎn)生豐富多樣、具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物，目前人們已從內(nèi)生菌中 找到許多具有各種生物活性的新物質(zhì)在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)方面顯示的重要的應用價值。據(jù)國內(nèi)外研究報道，在植物幼苗中引入微生物必將對幼苗的發(fā)育、代謝產(chǎn)生積極 影響，可增強對生物和非生物脅迫因子的抗性。接入內(nèi)生菌也可對植株生長和生理代謝進 行綜合調(diào)節(jié)，使之較快適應外界復雜環(huán)境。J Nowak將這種技術(shù)稱為“biotizafion”，諸如 菌根化(mycorrhization)、細菌化(bacterization)。將有益微生物與微繁苗進行共培養(yǎng)， 是生產(chǎn)高抗優(yōu)質(zhì)種苗的嶄新途徑，這對于中藥材的大規(guī)模高效優(yōu)質(zhì)栽培具有很好的應用前景。目前，國際上關(guān)于蘭科植物的內(nèi)生真菌研究較多，但內(nèi)生細菌的研究較少，更沒有鐵皮石斛內(nèi)生細菌用于促長鐵皮石斛組培面的研究報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鐵皮石斛內(nèi)生細菌——鞘氨醇單胞菌株，該 菌株用于鐵皮石斛種苗促生長，有助于解決目前鐵皮石斛種苗生產(chǎn)過程中組培苗生長緩 慢、生產(chǎn)周期長、成本較高的技術(shù)難題。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鞘氨醇單胞菌株，該鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SHl，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NO :M2010041。本發(fā)明還同時提供了上述鞘氨醇單胞菌株的用途用于鐵皮石斛種苗促生長。作為本發(fā)明的鞘氨醇單胞菌株的用途的改進將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO M2010041發(fā)酵原液或發(fā)酵液接種于鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培苗生 長。本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生菌是發(fā)明人從鐵皮石斛植株中分離到的一株細菌， 經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定和分子鑒定表明它屬于鞘氨醇單胞菌，將其命名為鞘氨醇單胞菌 SHl (Sphingomonas sp. SHl)。具體為該鐵皮石斛內(nèi)生菌分離自野生的鐵皮石斛植株的根，可通過如下方法從野生的鐵 皮石斛植株分離培養(yǎng)得到1)、將野生鐵皮石斛的根經(jīng)表面消毒處理后，切成小塊，接種于特制NA培養(yǎng)基平 板，于28 32°C下培養(yǎng)1 3天；該特制的NA培養(yǎng)基由基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基和研磨后的新鮮鐵皮石斛組成，基礎(chǔ)NA培養(yǎng) 基的成分組成為蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂15-20g* H2OlOOOml,在上述基礎(chǔ) NA培養(yǎng)基上添加5g研磨后的新鮮鐵皮石斛，并用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH = 7. 4 7. 6，得 特制的NA培養(yǎng)基。2)、挑取單菌落于同上述步驟1)的特制NA培養(yǎng)基平板劃線純化分離，置于28 32°C下培養(yǎng)1 3天；3)、重復多次分離純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生菌——鞘氨醇單胞菌菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)已于 2010年2月4號保藏在中國典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏號CCTCC NO =M 2010041。本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生菌一一鞘氨醇單胞菌SHl(以下簡稱為鞘氨醇單胞菌 CCTCCN0 :M 2010041)具有如下生物學特征1.菌落形態(tài)特征在基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基上生長良好，細菌菌落特征菌落呈圓形，黃 色，光滑，邊緣整齊，菌落中心突起脊狀。2.菌體形態(tài)特征球狀，直徑為0. 5 1. 5 μ m，革蘭氏陰性。3.主要生理生化特征該菌可在基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基上，在生長溫度為20 40°C、pH 值為6. 0 8. 0的環(huán)境中生長良好。4.遺傳學特征根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英，科學出版社， 2001)，本發(fā)明的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的形態(tài)特征上，與國內(nèi)命名的解聚乙 二醇鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas macrogoltabidus)最接近；經(jīng)該鞘氨醇單胞菌CCTCCM2010041的16S rDNA序列分析表明，鞘氨醇單胞菌CCTCC M 2010041應屬于鞘氨醇單胞菌
jM ο本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生細菌SHl對鐵皮石斛組培苗有促生長作用，可促進組培苗 的平均根長增加10% 25%，增加植株的高度10% 30%，增加植株的鮮種和干重5% 20%，可縮短鐵皮石斛組培苗的生產(chǎn)時間10 20天；對人畜無毒無害，對環(huán)境不造成污染。 可在鐵皮石斛組培苗的生產(chǎn)中得到應用，產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益。本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生細菌用于促進鐵皮石斛生長時，只需將該鐵皮石斛內(nèi)生細 菌一鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的發(fā)酵原液或發(fā)酵液接種于鐵皮石斛組培苗基 部，即可獲得促進鐵皮石斛組培苗生長的效果。
具體實施例方式實施例1、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的分離培養(yǎng)方法，依次進行以下步 驟1、于浙江桐廬采集野生的健康的鐵皮石斛植株的根樣品，用自來水充分清洗， 25KHz超聲波處理5分鐘；2、在無菌條件下，對步驟1所得的供試材料用無菌水沖洗2次，然后依次用體積 濃度75%的酒精和飽和漂白粉溶液對供試材料進行表面消毒，從而殺滅供試材料表面微生 物；3、在無菌環(huán)境中，將步驟2所得的供試材料用無菌水沖洗3次，取100 μ 1最后1 次沖洗所產(chǎn)生的無菌水沖洗液涂布接種于基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h后，觀察有無菌 落產(chǎn)生。據(jù)此驗證此消毒方法是否全部殺死供試材料表面微生物。如果觀察結(jié)論為沒有菌落產(chǎn)生，則進行下述的步驟4 ；如果觀察結(jié)論為有菌落 產(chǎn)生，則返回步驟2。4、將處理好的根樣品切成0. 5 Icm小段，接入特制NA培養(yǎng)基平板中，放置于 30°C培養(yǎng)1 3天；該特制NA培養(yǎng)基由基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基和新鮮鐵皮石斛研磨料渣組成；基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基 的成分組成為蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和H2OlOOOml,在上述基礎(chǔ)NA培 養(yǎng)基上添加5g研磨后的新鮮鐵皮石斛，并用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH = 7. 4 7. 6，得特制
NA培養(yǎng)基。5、挑取上述步驟4所得的特制NA培養(yǎng)基平板上長出的菌種于特制NA培養(yǎng)基平板 劃線純化分離，置于30°C培養(yǎng)1 3天，挑取單菌落；重復上述操作，直至得到單菌落為止。6、將步驟5挑取所得的單菌落接于特制NA培養(yǎng)基斜面保存于4°C冰箱中。所得的一種單菌落為鐵皮石斛內(nèi)生菌——鞘氨醇單胞菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)，已于2010年2月4號保藏在中國典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏地址中國武 漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NO =M 2010041。其序列如SEQID NO 1 所示。實施例2、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的培養(yǎng)制種方法，依次進行以下步 驟
5
1、將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基斜面，30°C培養(yǎng)2 天；得斜面種子；基礎(chǔ)NA培養(yǎng)基斜面配方為蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和 H2OlOOOml, ρΗ = 7. 4 7. 6。2、用接種環(huán)挑取0. 5g步驟1所得斜面菌種，接種于裝有100ml LB液體培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中，于28°C以200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30h，得鞘氨醇單胞菌CCTCC NO :M2010041 發(fā)酵原液；LB液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，酵母膏10g，NaCl 58和H201000ml，pH = 7. 4 7. 6。實施例3、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041對鐵皮石斛組培苗生長的促進實 驗下述實驗均用已在改良的鐵皮石斛組培培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗作 為實驗對象。改良的鐵皮石斛組培培養(yǎng)基的配方為采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加香蕉汁 10% /L，瓊脂7g/L，蔗糖20g/L，用lmol/L的NaOH調(diào)整ρΗ值為5.8。即在每L的1/2MS 中添加0. IL香蕉汁、7g瓊脂和20g蔗糖，并調(diào)整ρΗ值為5. 8。實驗1、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液對鐵皮石斛組培苗促生長試
驗一利用上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液，用無菌水 將發(fā)酵原液進行稀釋，使其菌液濃度調(diào)整為103CFU/ml，將該稀釋后發(fā)酵原液接種于已在改 良的鐵皮石斛組培培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 15天的25株鐵皮石斛組培苗基部，作為實驗組；具體 為在每株鐵皮石斛組培苗基部加入50 μ 1的稀釋后發(fā)酵原液。將相同體積的無菌水代替上述稀釋后發(fā)酵原液，其余內(nèi)容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在25°C恒溫、全天IOOOIx的光照強度條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果如下60天后可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況明顯優(yōu)于空白對照組， 實驗組中組培苗平均根長比空白對照組增加了 20.5%，植株高度比空白對照組增加了 17. 8%，組培苗植株鮮重和干重分別比空白對照組增加了 16. 3%和15. 9%。實驗2、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液對鐵皮石斛組培苗促生長試
驗二將稀釋后的菌液濃度由103CFU/ml改成lOtFU/ml，以在改良的鐵皮石斛組培培養(yǎng) 基中培養(yǎng)了 30天的鐵皮石斛組培苗作為實驗對象；其余等同實驗1。培養(yǎng)結(jié)果如下60天后可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況均明顯優(yōu)于空白對照組， 實驗組中組培苗平均根長比空白對照組增加了 11.3%，植株高度比空白對照組增加了 14. 7%，組培苗植株鮮重和干重分別比空白對照組增加了 10. 2%和9. 7%。實驗3、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵液對鐵皮石斛組培苗促生長試驗
將上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾，得無菌發(fā)酵液。取該無菌發(fā)酵液接種于已在改良的鐵皮石斛組培培養(yǎng) 基中培養(yǎng)了 15天的25株鐵皮石斛組培苗，作為實驗組；具體為在每株鐵皮石斛組培苗基 部加入50 μ 1的無菌發(fā)酵液；15天后，再在每株鐵皮石斛組培苗基部加入50 μ 1的無菌發(fā) 酵液。將相同體積的無菌水代替上述無菌發(fā)酵液，其余內(nèi)容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在同實驗1的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如下60天后可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況優(yōu)于空白對照組，實驗組 中組培苗平均根長比空白對照組增加了 7.8%，植株高度比空白對照組增加了 7.3%，組培 苗植株鮮重和干重分別比空白對照組增加了 6. 6%和6. 3%。實驗4、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵液對鐵皮石斛組培苗促生長試驗將上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾，得無菌發(fā)酵液。取該無菌發(fā)酵液接種于已在改良的鐵皮石斛組培培養(yǎng) 基中培養(yǎng)了 30天的25株鐵皮石斛組培苗，作為實驗組；具體為在每株鐵皮石斛組培苗基 部加入100 μ 1的無菌發(fā)酵液。將相同體積的無菌水代替上述無菌發(fā)酵液，其余內(nèi)容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在同實驗1的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如下60天后可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況優(yōu)于空白對照組，實驗組 中組培苗平均根長平均根長比空白對照組增加了 4.5%，植株高度比空白對照組增加了 5. 3%，實驗組中組培苗植株鮮重和干重分別比空白對照組增加了 6. 和5. 3%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種鞘氨醇單胞菌株，其特征是該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SH1，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NOM 2010041。
2.如權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌株的用途，其特征是用于鐵皮石斛種苗促生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鞘氨醇單胞菌株的用途，其特征是將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發(fā)酵原液或發(fā)酵液接種于鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培 苗生長。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鞘氨醇單胞菌株，該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SH1，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NoM 2010041。本發(fā)明還同時公開了上述鞘氨醇單胞菌株的用途用于鐵皮石斛種苗促生長；具體為將鞘氨醇單胞菌CCTCC NoM2010041發(fā)酵原液或發(fā)酵液接種于鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培苗生長。
文檔編號C12N1/20GK101921718SQ201010125409
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者俞婕, 張珊珊, 胡秀芳, 董飛, 趙凱鵬, 陳集雙 申請人:浙江理工大學