專利名稱：一種用地衣芽孢桿菌提取的活性成分及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用地衣芽孢桿菌提取的活性成分及其應用，屬于生物農藥技術領域。
背景技術：
隨著越來越多的有毒化學農藥逐漸被限制使用，生物農藥由于具有生產原料來源 廣泛，對非靶標生物安全、毒副作用小、及對環境兼容性好的特點，已成為全球農藥產業發 展的新趨勢。很多真菌的屬或菌種被用于來防治病蟲害如Trichoderma屬，尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum), Pythium oligandrum, Verticillium chlamydosporium 等。在利 用真菌開發生物農藥中，產生厚垣孢子是非常重要的，因為其含有豐富的內源營養，抗逆性 大大高于分生孢子和菌絲體，可以克服分生孢子制劑存活期短，商品貨架期短，而且可在土 壤中定殖而不需要添加外源營養，從而提高防效。真菌的不同種，其形成厚垣孢子的環境條件通常是有差異的，很多因素如營養、滲 透壓、光、PH值、溫度、空氣、細菌、藥物處理和植物的刺激均都能誘導真菌形成厚垣孢子。 Venkat Ram首先證明了從土壤中分離的細菌能誘導F. solani形成厚垣孢子，并認為是細 菌產生的代謝物誘導的。但到目前為止，文獻檢索未見地衣芽孢桿菌中的代謝產物能誘導 真菌形成厚垣孢子的公開報道。參考文獻[l]Venkat Ram, C. S. ,1952. Soil bacteria and chlamydospore formation in Fusariumsolani. Nature 22 :433
發明內容
本發明的目的在于提供一種能誘導真菌形成厚垣孢子的用地衣芽孢桿菌代謝物 提取的活性成分，為開發生物農藥制劑奠定基礎。本發明的地衣芽孢桿菌代謝物中提取的活性成分，經如下步驟得到a.生產菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis N27)，該菌株已于2010 年1月20日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，地址中國.北京.中關 村；保藏號CGMCC No 3585 ；b.將B. licheniformis N27的菌種接種到試管固體培養基斜面上，于28°C下培 養4天，獲得試管種，固體培養基的配方蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、瓊脂15g、蒸餾水 IOOOmUpH 7. 2 ；c.將試管種接種到每瓶裝100-350ml液體培養基的三角瓶中，在溫度25_32°C、 轉速為150-250rpm下搖床培養2-5天；液體培養基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水 1000ml ；d.將含有菌體的發酵液在45°C下減壓濃縮至原體積的十分之一，用正丁醇萃取3 次，正丁醇萃取部分在45°C下減壓濃縮至干，得粗浸膏；
e.將粗浸膏在硅膠H柱上，先用體積比為1-4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑 洗脫，然后用甲醇全部沖下，將甲醇沖下部分在45°C下減壓濃縮得X餾分； f.將X餾分用C18填料分離，依次用50-80%、100%的甲醇水洗脫，將100%甲 醇洗脫部分合并，在45 °C下減壓濃縮得Y餾分；g.將Y餾分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脫，每15秒接1滴，每瓶收集液體1ml， 將6-10瓶合并，得到地衣芽孢桿菌的活性成分Z。制備試驗用的哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)，少孢節叢孢 (Arthrobotrys oliospora) M^lk^fU (T. har zianum), ^klMM JlM (F. oxysporum) _ 禾中 于PDA(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂18克，自來水1000ml，pH自然)上，將少孢節 叢孢(Arthrobotrys oliospora)接種于CMA培養基(玉米粉20克，瓊脂18克，水1000 毫升)上，將這三株菌于28°C下培養10天。用無菌蒸餾水將孢子洗下后，調整孢子濃度為 104，凍于4°C冰箱中備用。將活性成分Z用DMSO (二甲基亞砜)配成IOyg/μ 1，在每個9cm平板中放入活 性成分c(8 μ 1)，以不添加活性成分的作為對照，然后倒入20mlPDA或CMA于平板內，使培 養基中活性成分C的濃度為4μ g/ml，待培養基凝固后，在以PDA為培養基的表面分別涂上 300 μ 1哈茨木霉(T. har zianum)，尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)，在含有CMA培養基的表面涂 上300 μ 1少孢節叢孢(A. oliospora)的孢子。培養18個小時后，在含有活性化合物Z的 平板內，這三株真菌都形成大量的厚垣孢子，而空白對照則需培養20天以后才開始產厚垣 孢子，且數量沒有含有活性化合物的平板內的多。地衣芽孢桿菌提取的活性成分經試驗表明能誘導哈茨木霉(T. harzianum)、尖 孢鐮刀菌(F. oxysporum)、少孢節叢孢(Arthrobotrys oliospora)形成厚垣孢子，能應用 于生物農藥制備中。本發明的用地衣芽孢桿菌發酵液提取的活性成分能誘導真菌形成厚垣孢子的代 謝物，為開發生物農藥制劑奠定基礎。
具體實施例方式下述實施例所用的固體培養和液體培養基的配方同發明內容部分所述。實施例一將B. Iicheniformis N27的菌種接種到試管固體培養基斜面上，于28°C下培養4 天，獲得試管種。將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝液體培養基100ml)，25°C下搖 床培養(轉速為150rpm)5天。將含有菌體的發酵液在45°C下減壓濃縮至原體積的十分 之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下減壓濃縮至干，得粗浸膏。將粗浸膏 在硅膠H填料上，先用體積比為1 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑洗脫，然后用甲醇全 部沖下，將甲醇沖下部分在45°C下減壓濃縮得X餾分。將X餾分用C18填料分離，依次用 50 %、100 %的甲醇水洗脫，將甲醇洗脫部分合并，在45 V下減壓濃縮得Y餾分；將Y餾 分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脫，每15秒接1滴，每瓶收集液體1ml，將6_10瓶合并，得 到地衣芽孢桿菌的活性成分Z。將培養基中活性成分Z的濃度配成4 μ g/ml，把真菌孢子 涂布于培養基表面，結果表明活性成分Z是能誘導哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum)、少孢節叢孢(Arthrobotrys oliospora)快速而高效的產生厚垣孢子的代謝物。
實施例二 將B. Iicheniformis N27的菌種接種到試管固體培養基斜面上，于28°C下培養4 天，獲得試管種。將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝液體培養基200ml)，28°C下搖 床培養(轉速為200rpm)3天。將含有菌體的發酵液在45°C下減壓濃縮至原體積的十分之 一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下減壓濃縮至干，得粗浸膏。將粗浸膏在 硅膠H柱上，先用體積比為3 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑洗脫，然后用甲醇全部沖 下，將甲醇沖下部分在45°C下減壓濃縮得X餾分。將X餾分用C18填料分離，依次用70%、 100%甲醇水洗脫，將100%甲醇洗脫部分合并后在45°C下減壓濃縮得Y餾分。將Y餾分 用S印hadexLH-20在甲醇下洗脫，每15秒接1滴，每瓶收集液體1ml，將6_10瓶合并，即為 能誘導厚垣孢子的活性成分Z。將培養基中活性成分Z的濃度配成4 μ g/ml，把真菌孢子 涂布于培養基表面，結果表明活性成分Z是能誘導哈茨木霉(T.harzianum)、尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum)、少孢節叢孢(Arthrobotrysoliospora)快速而高效的產生厚垣孢子的代 謝物。實施例三將B. Iicheniformis N27的菌種接種到試管固體培養基斜面上，28°C下培養4天， 獲得試管種。將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝350ml)，32°C下搖床培養(轉速為 250rpm)2天。將含有菌體的發酵液在45°C下減壓濃縮至原體積的十分之一，用正丁醇萃 取3次，正丁醇萃取部分在45 °C下減壓濃縮至干，得粗浸膏。將粗浸膏在硅膠H柱上，先用 體積比為4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑洗脫，然后用甲醇全部沖下，將甲醇沖下部分 在45°C下減壓濃縮得X餾分。將X餾分用C18填料分離，依次用80%，100%甲醇水洗 脫，將100%甲醇部分在45°C下減壓濃縮得Y餾分。將Y餾分用S印hadexLH-20在甲醇下 洗脫，每15秒接1滴，每瓶收集液體約1ml，將6-10瓶合并，即為能誘導厚垣孢子的活性成 分Z。將培養基中活性成分Z的濃度配成4 μ g/ml，把真菌孢子涂布于培養基表面，結果表 明活性成分C是能誘導哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)、少孢節叢孢 (Arthrobotrys oliospora)快速而高效的產生厚垣孢子的代謝物。
權利要求
一種用地衣芽孢桿菌發酵液中提取的活性成分，其特征在于活性成分經如下步驟得到a.生產菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis N27)，該菌株已于2010年1月20日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，地址中國.北京.中關村；保藏號CGMCC No3585；b.地衣芽孢桿菌的液體培養基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；c.地衣芽孢桿菌的發酵條件為每瓶裝100-350ml液體培養基，溫度25-32℃、轉速為150-250rpm，搖床培養2-5天；d.將含有菌體的發酵液在45℃下減壓濃縮至原體積的十分之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45℃下減壓濃縮至干，得粗浸膏；e.將粗浸膏在硅膠H柱上，用體積比為1-4∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑洗脫，然后用甲醇全部沖下，將甲醇沖下部分在45℃下減壓濃縮得X餾分；f.將X餾分用C18填料分離，依次用50-80％、100％的甲醇水洗脫，將100％甲醇洗脫部分合并，在45℃下減壓濃縮得Y餾分；g.將Y餾分用SephadexLH-20在甲醇下洗脫，每15秒接1滴，每瓶收集液體1ml，將6-10瓶合并，得到地衣芽孢桿菌的活性成分Z。
2.權利要求1所述的用地衣芽孢桿菌提取的活性成分，其特征在于該活性成分能 高效、快速地誘導哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)、少孢節叢孢 (Arthrobotrys oliospora)形成厚垣孢子的代謝物，能應用于生物農藥制備中。
全文摘要
本發明涉及一種用地衣芽孢桿菌提取的活性成分及其應用，屬于生物農藥技術領域。活性成分提取步驟生產菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformisN27)，保藏號CGMCC No3585；將B.licheniformis N27用液體發酵，培養基為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水1000ml；發酵條件為溫度25-32℃、轉速為150-250rpm，搖床培養2-5天；所得發酵液減壓濃縮得粗浸膏；粗浸膏依次用硅膠H、C18、SephadexLH-20分離得到活性成分Z。本發明的活性成分是具有能使在常規培養基下培養的真菌高效、快速形成厚垣孢子的代謝物，且用量少，應用于生物農藥制備中。
文檔編號C12N1/20GK101805715SQ20101013391
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者周敬偉, 張克勤, 李蕾 申請人:云南大學