專利名稱：驅動基因在胚中表達的元件及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及組織特異表達啟動子及其獲得方法和應用。
背景技術：
啟動子是指基因中一段能準確有效起始基因轉錄的DNA序列，通常位于基因上游。啟動子是基因表達調控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子(轉錄因子)相互作用來調控基因轉錄的水平及其時空表達的特異性。目前使用最廣泛的組成型啟動子是煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子。同時，人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子并初見成效，肌動蛋白(Actin)和泛素(WDiquitin)等基因的啟動子已被克隆。Mariani等成功地利用煙草花藥絨氈層特異表達基因啟動子TA^驅動核酸酶 Barnase, RnaseTl基因在花藥中特異表達，破壞絨氈層，獲得雄性不育油菜，這是首次通過基因工程創造出雄性不育系。小麥葉中表達ipt基因，提高細胞分裂素含量，可使葉綠素降解減緩，葉衰老變慢。水稻種子中富含谷蛋白(Glutelin)，分析發現GluB，GluD均在種子中特異表達。對GluB啟動子區的詳細分析還鑒定了決定其表達特異性的GCN4等核心元件。 以往已經利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅動八氫番茄紅素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成了本不存在的β胡蘿卜素(維生素A原)；也利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅動大豆鐵蛋白基因，使轉基因水稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且促使鐵蛋白主要在胚乳中而不是本來的糊粉層積累。然而，目前為止分離得到的水稻種子特異啟動子并不多，并集中于谷蛋白基因家族。傳統的獲得啟動子元件的方法往往存在通量低，針對性差，工作量大等缺點，而隨著測序技術的發展，許多植物的全基因組序列已經測序完成，生物芯片技術的進步以及生物信息學分析方法的完善使人們能夠從基因組學層面對植物基因的表達模式有一個全面的了解，而不是像以往只能局限于有限的基因。Haberer等通過對擬南芥和油菜基因組水平同源基因啟動子區的種間序列分析，利用類似的生物信息學方法得到了 384個新的順式元件，并檢測到了大部分的已知轉錄調控序列的存在，證明了該方法的可行性。而目前，尚未見有基因組層面尋找水稻種子特異啟動子(調控序列)或增強子的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供組織特異表達啟動子及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO 5所示。在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于與啟動子或啟動子片段操作性連接，調控目的基因在植物胚中特異性表達；其中，所述的啟動子片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點。在另一優選例中，所述的植物是具有胚、胚乳和/或種子結構的植物。
在另一優選例中，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。在本發明的另一方面，提供一種用于調控目的基因在植物胚中特異性表達的構建物，所述構建物依次具有如下元件(5’ 一3’ ):(多核苷酸-X)n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；其中，η為1-100的正整數；較佳地，η為1_50的正整數；更佳地為1_30的正整數； 如 η 可以為 2，3，4，6，8，10，12，16，20 ；其中X為無，或長度在I-IOObp ；較佳地l_50bp，更佳地l_20bp，更佳地l-10bp，更佳地l-5bp，如2、3bp的核酸；其中，啟動子的片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點。在一個優選例中，所述的啟動子或其片段含有TATA-盒結構。在另一優選例中，所述的啟動子選自(但不限于)煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子，或煙草花葉病毒(CaMV) 35S基本啟動子(CAMV35S mini promoter)。在另一優選例中，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動子具有SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。在另一優選例中，所述的構建物的啟動子或其片段下游還包括一目的基因。在另一優選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優選例中，所述的目的基因是結構基因。在另一優選例中，所述的目的基因序列位于所述啟動子序列的下游，且是與所述的啟動子序列直接鄰近的編碼基因的序列。通常，所述的核酸序列與目的基因序列的間隔小于IOOObp (優選的，小于500bp ；更優選的，小于200bp ；更優選的，小于IOObp ；最優選的， 小于50bp)。在另一優選例中，所述的目的基因包括(但不限于)β_葡萄糖苷酶(GUS)基因、 改善稻米或種子品質相關的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)。在另一優選例中，所述的多核苷酸、啟動子、目的基因可操作性地相連。在另一優選例中，所述的構建物是表達載體。在本發明的另一方面，提供一種植物細胞(優選為非繁殖材料)，所述的細胞中含有所述的多核苷酸或所述的構建物。在本發明的另一方面，提供所述的構建物的用途，用于調控目的基因在植物胚中特異性表達。在本發明的另一方面，提供一種調控目的基因在植物胚中特異性表達的方法，所述方法包括(1)提供一構建物(表達載體)，所述構建物依次具有如下元件(5’ 一 3’)(多核苷酸-X)n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO 5所示；η 為1-100的正整數；X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中啟動子的片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構建物的下游；(3)將步驟⑵插入目的基因的構建物轉入到植物細胞或組織中；和
(4)將步驟C3)獲得的轉入了所述多核苷酸的植物細胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的胚中特異性表達。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了構建的表達載體的示意圖。圖2顯示了 35S基本啟動子不會使GUS在種子中表達。圖3顯示了胚乳特異基序(pESl，3，4)的組織特異性表達情況。圖片第一行為種子，第二行為花，第三行為葉，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區域為發生GUS染色的區域。圖4胚乳特異基序(pES》，胚特異基序(pBYl)、種子特異基序(pRSl)的組織特異性表達情況。圖片第一行為種子，第二行為葉，第三行為花，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區域為發生GUS染色的區域。圖5顯示了順式作用元件(cis-element)預測的主要流程。
具體實施例方式本發明人通過廣泛而深入的研究，首次通過篩選分離到一種指導基因在特定植物組織中特異性表達的多核苷酸(基序)，所述的多核苷酸在與啟動子或啟動子片段(如基本啟動子)連接后，可指導下游的目的基因特異性地表達在植物的胚中。因此，可應用該多核苷酸來調控植物組織中基因的表達，從而實現植物品種改良等。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，除非另外說明，所述的“多核苷酸”或“基序(motif)”是指一條對于調控基因的表達有用的核苷酸序列(序列單位)，其可以作為一種順式元件，也可以作為一種增強子。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中。所述的“啟動子片段”是指具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點的該啟動子的片段；也即，該“啟動子片段”保留了其相應的啟動子的基本功能。較佳地，所述的啟動子片段可以是基本啟動子或核心啟動子。如本文所用，“順式調控元件”或“順式元件”是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守性堿基序列。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本發明的基序和啟動子指導表達的基因。合適的目的基因包括但不限于葡萄糖苷酶(GUQ基因、改善植物品質或性狀或表型相關的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)、以及種子中激素合成相關基因等。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，術語“特異性表達”是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織表達。“組織特異性”又稱“器官特異性”，在一些調控元件的調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出其相關的發育調節的特性。本發明中，所述的“組織特異性表達”是指在植物胚乳、胚或種子中特異表達。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優選至少高10倍，更優選至少高100倍，最優選至少高1000 倍水平被表達，則認為相關基因的表達是組織或器官特異性的。如本文所用，所述的“植物”是具有胚、胚乳結構的植物。本領域人員熟知，植物胚或胚乳的組成成分是相似的，具有胚或胚乳結構的植物具有共同的特性，其基因組中存在許多保守的調控基因轉錄、表達的基因或調節元件，例如一系列調控植物形成胚或胚乳的元件。因此可以確定可以調控目的基因在禾本科植物的胚或胚乳或種子中特異性表達的基序(或基序-啟動子)也可以調控目的基因在禾本科植物以外其它具有胚或胚乳結構的植物產生同樣的表達特性。作為本發明的優選方式，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱寸。如本文所用，所述的“非繁殖材料”是指一種生物材料，其不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物合成碳水化合物、蛋白質來維系生存的特性。本發明提供一種調控目的基因在植物組織特異性表達的基序，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :6 任一所示。其中，如 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ IDNO :3 或 SEQ ID NO :4 任一所示的基序可驅動目的基因在禾本科植物的胚乳中特異性表達，其核苷酸序列；如SEQ ID N0:5所示的基序可驅動目的基因在禾本科植物的胚中特異性表達，其核苷酸序列；如SEQ ID NO 6 所示的基序可驅動目的基因在禾本科植物的種子中特異性表達。多核苷酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發明還涉及與前述指定的核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少80%，較佳地至少90%，更佳地至少95%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。“嚴格條件”或“嚴緊條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫， 如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. l%Fic0ll，42°C等；或C3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選60%以
6上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調控作用。本發明還包括與本發明的任一種基序序列具有80%以上，更優選90%以上，最優選95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調控作用。“相同性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。本發明人發現，在所述的基序-啟動子的指導下，可以使葡萄糖苷酶(GUS)基因特異地在植物的胚乳、胚或種子中表達。因此可見，本發明的基序是一種組織或器官特異性的調控序列。其對于定點地改良植物的品質(通過驅動目的基因特異性表達)是特別有用的。葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產生具有發色團或熒光的物質，可用分光光度計、熒光計或組織化學等方法對GUS活性進行定量和空間定位分析。在本技術領域中，GUS基因已被廣泛地用作轉基因植物、細菌和真菌的報告基因，特別是其可被用于研究外源基因表達的具體細胞和組織部位。本發明的組織特異性表達相關基序在理論研究和農藝改良中具有重要的應用價值。這些基序可以被應用于標記特定組織，引導特定的功能基因在特定的組織中表達，以及應用于特有組織的生長發育研究和針對性改良。所述的基序可以是多次重復(如2-100 次)的，一般多次重復可以使功能加強，即增強子的效果是可以累加的，增強子序列合在一起，即使其中間插入一些別的序列，轉錄加強的作用也會大大增強(參見朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現代分子生物學；高等教育出版社；2007)。通常，多次重復序列中，兩個基序之間插入其它序列(間隔序列)的長度在I-IOObp，較佳地l-50bp，更佳地l-20bp，更佳地I-IObp， 更佳地Hbp，如2、!3bp。所述的間隔序列例如是酶切位點等。多次重復序列對于轉錄作用的加強還可參見陳俊，楊之帆，張文雋；4X3^增強子的克隆及其功能驗證；華中科技大學學報(自然科學版)，2006，02，118-121 ；脅等亦發現，對于水稻基因Glu-Bl的啟動子中決定其胚乳表達特異性的GCN4基序，隨著人工構建使其重復次數的增多，其驅動的報告基因的表達水平也相應得到增強(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J. 1998，14，673—83)。本發明的基序通常與啟動子(如基本啟動子)操作性連接，再與目的基因操作性連接，從而驅動目的基因的特異性表達。所述的啟動子或其片段沒有特別的限制，只要其含有TATA-盒結構，可引發轉錄， 且在與所述基序連接后對于啟動下游基因表達是有用的。所述的TATA-盒結構序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并被本領域廣泛應用于啟動子研究中。在啟動子上，TATA盒一般處于非常接近轉錄起始點(通常于50個堿基對以內)的位置。本發明所述的啟動子含有TATA-盒結構，如煙草花葉病毒35S基本啟動子 (CAMV35S mini promoter)。35S基本啟動子區主要即TATA-盒結構區，該結構序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在(朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現代分子生物學；高等教育出版社；2007)，并被廣泛應用于啟動子研究中，Sien等(Shen H，Yang HJ, Wang ZY.Inducible Expression of OsEBP—89 Gene inRice. Journal Of PlantPhysiology and Molecular Biology,2004,30 (1) :87-93), Wu 等(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J. 1998,14,673-83 ；Wu C, Washida H, Onodera Y, Harada K, Takaiwa F. Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGTand AACA motifs in a rice glutelin gene promoter :minimal cis—elementrequirements for endosperm-specific gene expression. Plant J. 2000,23,415-21), Yoshihara 等(Yoshihara Τ, Washida H, Takaiwa F. A 45_bp proximal regioncontaining AACA and GCN4 motif is sufficient to confer endosperm-specificexpression of the rice storage protein glutelin gene, GluA-3. FEBS Lett. 1996，383，213-8)人在研究中均將不同啟動子(增強子)與35S 基本啟動子融合來啟動目的基因的表達。作為本發明的一個實例，所述的啟動子是煙草花葉病毒(CaMV)35S的基本啟動子 (CAMV35S mini promoter)，其含有TATA-盒結構區，該結構序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并已被廣泛應用于啟動子研究中。所述的35S的基本啟動子的序列如 CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG AGAG (SEQID NO :27)。所述的啟動子與基序之間直接相連，或者，它們之間還含有其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列的長度在Ι-lOOObp，較佳地l-500bp，更佳地l-200bp，如100bp，50bp， 20bp，10bp。當然，其它長度(如更長)的間隔序列也是可以存在的，只要其存在不影響上述各元件之間的操作性相連，不抑制基因的轉錄和表達。所述的間隔序列例如是酶切位點或隨機序列等。所述的目的基因相對于基序和啟動子而言可以是外源(異源)的。對所述目的基因的核酸序列沒有特別的限制(如一種結構性核酸序列)，所述的目的基因優選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些在農業或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合適的目的基因包括但不限于改良植物品質、性狀或代謝相關的基因。所述的基序和啟動子還可以與被改進的目的基因序列可操作地連接，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產物轉運到細胞外，改善蛋白的穩定性，插入或刪除細胞信5寸。此外，所述的基序和啟動子可以設計成下調特定基因。這一般是通過將基序和啟動子連接到目的基因序列上來實現，該序列以反義反向被引導。本領域的普通技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被調節。任何一種前述的啟動子和/或目的基因序列可被包含在重組構建物(重組載體) 中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發明的基序，在所述的基序的下游包括啟動子，在所述啟動子的下游包含多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時， 將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點內，從而將目的基因與基序-啟動子可操作地連接。作為另一種方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向)引導目的基因轉錄的
8基序-啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領域熟知的。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要其能夠在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都是可以被采用的。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含有本發明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發明的基序-啟動子，還可含有一種或多種其它基序或啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒19S和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增強的CaMV、煙草RB7等。包含上述適當的啟動子和目的基因的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母； 植物細胞等。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。作為一種方式，制備轉基因植物的方法是將攜帶基序-啟動子和目的基因(可操作地連接)的表達載體轉入農桿菌，農桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉基因受體植物例如是水稻、小麥、大麥和玉米。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、表達特異性的基序的初步篩選本發明取材營養組織(根，葉，苗)，以及不同發育階段的水稻種子并將其分為胚和胚乳，制作affymatrix芯片。利用該芯片，可以比較準確的分離出在水稻種子中特異表達的基因。本發明人將胚(或者胚乳)作為一個分析元素，將營養組織作為另一個分析元素，找出相對營養組織特異表達(顯著高表達)的基因，對其進行非監督聚類，得到表達模式相近的基因組，對每一組基因啟動子區進行比對(根據基序的相似性，所處位置，以及gibbs能量等原則)，獲得候選的可能決定了基因表達特異性的基序(motif，可能為順式元件，也可能屬增強子)。對這部分候選基序本發明人要進行二次過濾篩選。首先，計算候選基序在整個基因組范圍內以及在種子特異表達基因中的超幾何分布，檢驗其是否高度集中在種子特異高表達的基因里，選出有顯著差異的基序作后續分析；其次，根據第一次篩選的結果，將其與 PLACE(Plant cis-acting Regulatory DNAElements)和 AGRIS(The Arabidopsis Gene Regulatory Information Server)數據庫中己知植物順式元件相比對， 去掉已知元件，得到的成員即為最后的計算結果，用于下一步實驗驗證。順式作用元件預測的主要流程見圖5。過濾篩選前得到結果中，包含有大部分已知的水稻胚或胚乳特異順式元件，超幾何分布差異分析表明其在種子特異表達基因中顯著密集(P < 0. 05)，證明了本計算方法的可行性。另外根據對PLACE和AGRIS中已知元件長度的統計，本發明人選取分析的基序長度處于6 31bp范圍內。最終，計算得出胚乳特異基序13個，胚特異基序18個，見表1。表1、ρ < 0. 05且在數據庫中沒有匹配序列的基序胚(pBY)和種子(pRS)
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
2.權利要求1所述的多核苷酸的用途，用于與啟動子或啟動子片段操作性連接，調控目的基因在植物胚中特異性表達；其中，所述的啟動子片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點。
3.一種構建物，其特征在于，所述構建物依次具有如下元件(5’一 3’)(多核苷酸-X) n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；其中，η為1-100的正整數；其中，X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中，啟動子的片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點。
4.如權利要求3所述的構建物，其特征在于，所述的啟動子或其片段含有TATA-盒結構。
5.如權利要求3或4所述的構建物，其特征在于，所述的啟動子或啟動子片段選自煙草花葉病毒35S啟動子，或煙草花葉病毒35S基本啟動子。
6.如權利要求5所述的構建物，其特征在于，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動子具有 SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。
7.如權利要求3所述的構建物，其特征在于，所述的構建物的啟動子或其片段下游還包括一目的基因。
8.如權利要求3所述的構建物，其特征在于，所述的構建物是表達載體。
9.一種植物細胞，其特征在于，所述的細胞中含有權利要求1所述的多核苷酸或權利要求3-8任一所述的構建物。
10.權利要求3-8任一所述的構建物的用途，用于調控目的基因在植物胚中特異性表達。
11.一種調控目的基因在植物胚中特異性表達的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一構建物，所述構建物依次具有如下元件(5’一3’)“多核苷酸-幻…啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:5所示；11為1-100的正整數； X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中啟動子的片段具有該啟動子的引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構建物的下游；(3)將步驟( 插入目的基因的構建物轉入到植物細胞或組織中；和(4)將步驟C3)獲得的轉入了所述多核苷酸的植物細胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的胚中特異性表達。
全文摘要
本發明涉及組織特異表達啟動子及其獲得方法和應用。本發明首次通過篩選分離到一條多核苷酸，所述的多核苷酸在與啟動子連接后，可指導下游的目的基因特異性地表達在植物的胚中，可應用這些多核苷酸來調控植物組織中基因的表達，從而實現植物品種改良。
文檔編號C12N15/63GK102206637SQ201010134090
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者溫碧清, 薛紅衛 申請人:中國科學院上海生命科學研究院