扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因及其應用。該基因為MrLEA2編碼基因，來源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或者具有序列表中SEQIDNO.1中因一個或多個堿基的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因；或者具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質；或者具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQIDNO.2氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO.2衍生的蛋白質。本發明所獲得的基因可用于改良植物和微生物的抗鹽、抗凍和耐熱性。
【專利說明】扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物基因工程【技術領域】，尤其涉及扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因及其應用。
【背景技術】
[0002]晚期胚胎發生豐富蛋白(Lateembryogenesis abundant potein, LEA)最早發現于棉花種子中，因其在胚胎發育后期大量積累而得名(Dure et al.，1981)，同時低溫、干旱以及鹽堿等脅迫，以及脫羧酸(ABA)也會誘導晚期胚胎發生豐富蛋白在植物營養器官中積累。后續研究發現，晚期胚胎發生豐富蛋白不僅存在于植物中，而且在耐輻射球菌(Deinococcus radiodrurana)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、齒蟲(Artemia)、線蟲以及輪蟲(rotifer)中也發現存在晚期胚胎發生豐富蛋白的證據。根據氨基酸序列特征、氨基酸組成上的差異，可將晚期胚胎發生豐富分為不同的類群。
[0003]晚期胚胎發生豐富蛋白在細胞內的功能與細胞脫水保護有關。通過轉基因技術，將大麥中的HVAl基因轉入小麥和水稻，可提高轉基因植株的抗旱性；過量表達小麥PM80和PMA1959能夠改善水稻植株的抗脫水脅迫能力；將柑橘中編碼晚期胚胎發生豐富蛋白CuC0R19的基因導入到煙草中后能夠提高轉基因植株的抗冷性；在擬南芥中，將小麥WCS19、擬南芥C0R15A基因單獨過量表達，或者將RAB18、CORl7, C0R47、XER02和ERDlO五個基因同時過量表達均能夠提高轉基因植物抵御凍害的能力；小麥脫水蛋白基因WC0R410(晚期胚胎發生豐富蛋白家族成員之一)過表達能夠增強草莓的抗凍性。因此，晚期胚胎發生豐富蛋白可能是包括植物、細菌以及低等動物細胞獲得脫水忍耐性的決定性因素之一，盡管其具體的機制尚不清楚。同時，晚期胚胎發生豐富蛋白基因也在植物干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫抗性改良中具有重要的潛在應用價值
除了植物遺傳轉化試驗以外，利用大腸桿菌和酵母等異源表達系統也被廣泛用來進行晚期胚胎發生豐富蛋白的鑒定。在酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞中小麥晚期胚胎發生豐富蛋白過量表達能夠提高滲透脅迫的耐受性；將大麥、輪藻的晚期胚胎發生豐富蛋白引入酵母后可以獲得對高鹽和冷凍脅迫的耐受性。大豆晚期胚胎發生蛋白在大腸桿菌中過表達，能夠提高細菌對鹽脅迫的耐受性。因此，利用酵母、大腸桿菌表達系統可以作為鑒定晚期胚胎發生豐富蛋白的高效快速體系。
[0004]扁猜豆(Medicago ruthenica)廣泛分布于我國北方地區，具有極強的抗逆境能力，是唯一能夠在高海拔極端高寒地區正常越冬的苜蓿屬多年生豆科牧草。目前還沒有扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因克隆和抗逆性功能鑒定的報道。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種改良植物和微生物抗鹽、抗凍和耐熱性的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因。
[0006]本發明所要解決的另一個技術問題是提供基于該基因在植物和微生物抗鹽、抗凍和耐熱改良方面的應用。
[0007]為解決上述問題，本發明所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，其特征在于:該基因為MrLEA2編碼基因，來源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
[0008]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位中因一個或多個堿基的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。
[0009]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所不的氣基酸殘基序列的蛋白質。
[0010]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0.2氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質；所述由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質的序列與所述等位基因的序列相對應。
[0011]如上所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因在改良植物和微生物抗鹽、抗凍和耐熱方面的應用。
[0012]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、本發明通過轉錄組學分析，從而表明扁蓿豆含有晚期胚胎發生豐富蛋白基因。而本發明通過RT-PCR技術，在扁蓿豆中分離到一個新的晚期胚胎發生豐富蛋白基因及其編碼基因MrLEA2。用原核表達手段，將MrLEA2基因編碼區鏈接到大腸桿菌表達載體后，將該原核表達載體轉入大腸桿菌表達菌株，用IPTG誘導后實現了 MrLEA2蛋白在大腸桿菌中的過量表達，結果顯示，MrLEA2蛋白過量表達在逆境脅迫下對大腸桿菌具有保護效果，因此，通過生物技術方法可將該基因用于改良植物和微生物的抗鹽、抗凍和耐熱性。
[0013]2、通過對本發明中的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因進行RT-PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳(如圖1，圖4-7所示)，可以看到扁蓿豆具有1.2kb的蛋白質條帶，因此，表明在扁蓿豆中有晚期胚胎發生豐富蛋白基因表達。
[0014]3、通過將本發明中的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因的編碼區連接到大腸桿菌表達載體，經過酶切鑒定后(如圖8所示)，轉化大腸桿菌表達載體，經含有如上述構建的MrLEA2基因的原核表達載體的大腸桿菌經過IPTG誘導后，對培養物菌體總蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果顯示誘導后的大腸桿菌培養物種具有一條與預期分子量相近的蛋白條帶(如圖9所示)，因此扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2能夠在大腸桿菌中過量表達。
[0015]4.通過對過量表達本發明中的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2在大腸桿菌在含有高鹽脅迫、熱脅迫和凍融處理，觀察如上所述大腸桿菌的生長存活情況，結果顯示MrLEA2蛋白過量表達能夠提高大腸桿菌宿主對高鹽脅迫、熱脅迫和凍融處理的耐受性(如圖l(Tll所示)，因此MrLEA2蛋白在高鹽脅迫、熱脅迫和凍融處理下對細胞具有保護效果。
[0016]5、本發明的基因結構特征:
本發明根據對扁蓿豆轉錄組測序結果，設計PCR引物，其中引物P1+P2用于擴增含有5’ -和3’ -非翻譯區和編碼區的MtLEA2基因序列(圖1-2)，引物P3+P4擴增MrLEA2基因編碼區核苷酸序列，用于原核表達鑒定克隆基因的功能活性。
[0017]用引物P1+P2，扁蓿豆cDNA為模板進行擴增，得到約1.2kb的條帶(圖1)。測序后獲得MrLEA2基因1181bp如圖2和序列表SEQ ID N0.1所示的含有5’-和3’-非翻譯區和編碼區的MtLEA2基因序列，其中57-1025位為翻譯區。由SEQ ID N0.1序列推導出的氨基酸序列如圖2和序列表SEQ ID N0.2所示。該氨基酸序列顯示，蛋白質產物由322個氨基酸殘基組成，其中天冬氨酸、異亮氨酸和賴氨酸分別占氨基酸殘基總數的11.8%，分子量為36.1kD,等電點為 4.55,平均疏水性(Grand average hydropathy, GRAVY)指數為-0.4276,具有較強的親水性。Pfam數據庫(http://pfam.janelia.0rg)數據庫對MrLEA2編碼的氨基酸序列的結構域進行搜索表明，MrLEA2蛋白屬于LEA_2蛋白家族，存在兩個保守的分別位于81位到174位之間和205位到299位氨基酸之間的LEA_2蛋白結構域(圖3)。在NCB數據庫中利用BLAST對MrLAE2編碼蛋白質的氨基酸序列和其它物種蛋白質氨基酸序列比較(圖3)發現與截型苜猜(Medicago truncatula)氨基酸序列一致性(identity)最高,為96%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0019]圖1為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白RT-PCR克隆產物電泳圖譜。
[0020]圖2為本發明MrLEA2基因cDNA序列及其所編碼蛋白質的氨基酸序列。
[0021]圖3為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2和其它物種LEA_2蛋白氨基酸序列的比對分析；其中MtLEA14 (XP_003617191.1)來自截型苜蓿(Medicago truncatula), TcLEA2 (E0Y06968.1)來自可可(Theobroma cacao), GmT,RA2(NP_001241079.1)來自大 ? (Glycine max), At2g44060 來自擬南芥(Arabidopsisthaliana).下劃線LEA_2蛋白示兩個保守區段。
[0022]圖4為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因在模擬脫水脅迫處理下基因表達水平的半定量RT-PCR分析，actin為用于內標的扁蓿豆肌動蛋白基因。
[0023]圖5為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因在模擬NaCl脅迫處理下基因表達水平的半定量RT-PCR分析，actin為用于內標的扁蓿豆肌動蛋白基因。
[0024]圖6為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因在ABA處理下基因表達水平的半定量RT-PCR分析，actin為用于內標的扁蓿豆肌動蛋白基因。
[0025]圖7為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因在低溫處理下基因表達水平的半定量RT-PCR分析，actin為用于內標的扁蓿豆肌動蛋白基因。
[0026]圖8為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2的原核表達載體pET_MrLEA2的酶切鑒定圖譜。其中”B/S”為BamH I和Sac I雙酶切消化處理的pET_MrLEA2載體，”B”為BamH I單酶切消化處理的pET_MrLEA2載體，”S”為Sac I單酶切消化處理的pET_MrLEA2載體，” P”為未做酶切消化處理的pET-MrLEA2載體。
[0027]圖9為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達的SDS-PAGE鑒定。其中pET和LEA分別表示含有pET_30a(+)和pET_MrLEA2載體的總蛋白，和“ + ”分別表示IPTG誘導前和誘導后的總蛋白，實心三角符號指示誘導表達的MrLEA2目的蛋白條帶。
[0028]圖10為本發明扁猜?晚期胚胎發生豐g蛋白MrLEA2在大腸桿囷中表達后對宿主菌的逆境脅迫保護效果的菌液滴板試驗。其中NaCl和KCl為高鹽脅迫、Heating和冷凍Freezing分別為50°C熱脅迫和凍融處理，pET和LEA分別表示含有pET_30a(+)和pET-MrLEA2載體的BL21 (DE3)大腸桿菌菌株。
[0029]圖11為本發明扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2在大腸桿菌中表達后對宿主菌的逆境脅迫保護效果的菌落計數統計結果。其中NaCl和KCl為高鹽脅迫、Heating和冷凍Freezing分別為50°C熱脅迫和凍融處理，pET和LEA分別表示含有pET_30a(+)和pET-MrLEA2載體的BL21 (DE3)大腸桿菌菌株。
【具體實施方式】
[0030]實施例1扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，該基因為MrLEA2編碼基因，來源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
[0031]一、扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白MrLEA2基因的克隆。
[0032]1、扁蓿豆幼苗低溫脅迫處理與轉錄組測序:
⑴扁蓿豆低溫脅迫處理: 將扁蓿豆種子用濃硫酸處理IOmin后，用自來水沖洗去除殘余硫酸。上述經過處理的種子置于鋪有雙層濾紙培養皿，在21°C、16h/8h光周期條件下發芽；14d以后，將幼苗移栽到蛭石中繼續在上述條件下培養，每周用不含1/2MS營養液澆灌一次；14d以后將幼苗轉移至-4°C光照培養培養箱進行低溫處理24h，在低溫處理前和處理后，取整株幼苗，清洗干凈根部，用吸水紙洗凈剩余水分后液氮速凍，-80 V保存。
[0033]⑵轉錄組測序:
將低溫處理前和處理后的幼苗，送深圳華大基因科技服務有限公司進行總RNA提取和轉錄組測序。
[0034]2、引物設計:
根據轉錄組測序結果設計PCR引物，具體如下:
Pl 5， -CTCTCTCTCTCTCTCTCATCACTG-3，
P2 5’ -CTGACTGAACGGACATACTCACT-3’
3、總RNA提取與cDNA第一鏈合成:
將上述低溫脅迫處理的樣品在液氮中研磨成粉末后，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)按照其說明書提取總RNA。總RNA用501 μ L DEPC水溶解，調整濃度為IOOng/ μ L。
[0035]cDNA第一鏈合成反應使用PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)(Takara,大連)試劑盒按照其說明書進行。
[0036]4、MrLEA2 基因 cDNA 序列擴增:
PCR 反應體系由 10 yL 2X Buffer Ι,16μ L dNTPU μ I Pl (10 μ Μ)、1 μ I Ρ2(10 μ Μ),0.1 μ I L LA Taq DNA 聚合酶(Takara 產品)、0.1μ1 Pyrobest DNA 聚合酶(Takara產品)、I μ I cDNA第一鏈合成產物組成，并用ddH20(重蒸水)加至終體積為20 μ I。
[0037]其中:2X Buffer I為與LA Taq DNA聚合酶配套緩沖液。
[0038]dNTP由dATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (脫氧胸苷三磷酸)、dGTP (脫氧鳥苷三磷酸三鈉)和dCTP (脫氧胞苷三磷酸)組成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均為2.5mM。
[0039]PCR反應體系按下列程序進行:
【權利要求】
1.扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，其特征在于:該基因為MrLEA2編碼基因，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位中因一個或多個堿基的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。
3.如權利要求1所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所不的氣基酸殘基序列的蛋白質。
4.如權利要求3所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0.2氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質；所述由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質的序列與所述等位基因的序列相對應。
5.如權利要求1、2、3或4所述的扁蓿豆晚期胚胎發生豐富蛋白基因在改良植物和微生物抗鹽、抗凍和耐熱方 面的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103911385SQ201410166211
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】王海慶, 馬超, 沈迎芳, 竇全文, 陳志國 申請人:中國科學院西北高原生物研究所