專利名稱：反轉(zhuǎn)錄pcr分析ivf單個植入前胚胎的基因表達(dá)中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pcr體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種IVF(In Vitro Fertilization,試管受精)單個植入前胚胎的基因表達(dá)分析方法，特別涉及以一種利用改良實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)分析IVF單個植入前胚胎的基因表達(dá)中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR 體系。
背景技術(shù)：
1978年7月25日，世界上第一個成功的“試管”嬰孩(IVF，體外受精)路易絲喜悅布朗，在英國出生。從此，IVF為全球超過占10%的不孕癥夫婦帶來了福音。發(fā)明IVF的英國科學(xué)家羅伯特愛德華茲教授被授予2010年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎。然而，三十多年的臨床實踐并沒有顯著提高IVF的成功率。如，2011年，美國妊娠協(xié)會統(tǒng)計35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而嬰兒出生率更低。其中一個重要的原因是IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這是IVF胚胎質(zhì)量最重要的決定性因素之一。目前，選擇植入母體的囊胚期胚胎主要是根據(jù)胚胎的形態(tài)學(xué)特性。而迄今尚未有一種特殊的生物學(xué)標(biāo)記及監(jiān)測手段來確定培養(yǎng)液和胚胎質(zhì)量。胚胎質(zhì)量與胚胎學(xué)家的經(jīng)驗密切相關(guān)。這種人為的選擇實際上存在潛在的危險性。因為即使有優(yōu)良形態(tài)學(xué)特性的胚胎仍可能存在基因突變和缺陷。如Sirtuins蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝功能，在IVF植入前胚胎期發(fā)揮了重要的作用。Sirt3基因的缺陷誘導(dǎo)了腫瘤抑制蛋白trp53的表達(dá)而抑制了胚胎的發(fā)育。如果sirt3基因和trp53基因同時缺陷，可改善胚胎的發(fā)育。這種情況也可見于單獨trp53基因缺陷時，而胚胎表現(xiàn)為正常的形態(tài)學(xué)特性。在利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chainsreaction) 方法檢測小鼠受精卵體外培養(yǎng)72-96小時后的胚胎發(fā)現(xiàn)一組胚胎中總的腫瘤抑制基因 trp53mRNA總量明顯低于體內(nèi)生長的同期胚胎。RNA微陣列(RNA Microarray)也顯示小鼠一組IVF囊胚期胚胎明顯比體內(nèi)生長的囊胚期胚胎表達(dá)了低的trp53mRNA。目前尚未知道這組胚胎中有多少個胚胎不表達(dá)trp53，如果這個trp53基因缺陷的胚胎植入至母體，下一代的腫瘤發(fā)生率無疑將大大增高。Microarray顯示小鼠受精卵體外在Whitten氏培養(yǎng)液和KSOM+氨基酸培養(yǎng)液培養(yǎng)96小時所形成的囊胚期胚胎分別有114和29個基因表達(dá)異常。我們對目前臨床常用的三種IVF培養(yǎng)液中生長成的小鼠囊胚期胚胎的分析顯示52-102 個基因表達(dá)異常，異常程度非常不同，而且影響了許多關(guān)鍵的細(xì)胞功能和重要器官的發(fā)育。 例如1.決定干細(xì)胞潛能性的轉(zhuǎn)錄因子，Nanog和UTFl ；2.干細(xì)胞分裂和維持功能；3.心室肌細(xì)胞的發(fā)育，肺泡細(xì)胞的發(fā)育，大腦皮層神經(jīng)元的分化和突觸的發(fā)育；4. B淋巴細(xì)胞的分化；5.細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)；6.細(xì)胞清除極低密度脂蛋白的能力，等等。這說明目如臨床常用IVF培養(yǎng)液可能存在缺陷，也就是說迄今我們尚未有最理想的IVF培養(yǎng)液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段來監(jiān)測IVF培養(yǎng)液的質(zhì)量。雖然微陣列(MiciOarray)分析提供了強(qiáng)有力的工具來分析單一實驗過程中成千上萬個基因的表達(dá)。然而它并不適合于樣品的RNA量相當(dāng)小的時候(對于Microarray,通常每個樣品至少需要50ng RNA，我們的經(jīng)驗需要100個以上囊胚期胚胎)。這不可能用人類單個IVF病例的100個囊胚期胚胎作Microarray分析,換句話說,Microarray目前并不能作為人類檢測IVF胚胎的基因表達(dá)的手段。另一種重要的情況是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表達(dá)形式差別很大，尤其當(dāng)被測基因的RNA轉(zhuǎn)錄子的豐度低，而且它的轉(zhuǎn)錄子壽命又較短，而這種特性可能在調(diào)節(jié)植入前胚胎期功能發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，這種瞬時表達(dá)的基因用Microarray分析技術(shù)也不易監(jiān)測到。

發(fā)明內(nèi)容
為解決RNA Microarray在基因表達(dá)分析中的不足，本發(fā)明提供了一種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR，這是一種有效的用于分析基因在單個細(xì)胞和單個植入前期胚胎表達(dá)的方法。這種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)操作要求相當(dāng)高，但非常敏感，高度精確，同時能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補(bǔ)Microarray的不足，對分析單個關(guān)鍵基因在單個細(xì)胞的表達(dá)和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價值。這種技術(shù)還提供了有效的方法去檢測那些潛在重要的瞬時表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄子，和怎樣估價并且解釋在總RNA池完成的基因表達(dá)分析的結(jié)果，不至于掩蓋那些相對穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子的重要信息。為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明建立的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達(dá)方法包括以下步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR檢測； 使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時放大擴(kuò)增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達(dá)量；以及進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。本發(fā)明還提出了利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達(dá)方法中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實時定量PCR檢測的反應(yīng)體系，所述的PCR檢測的反應(yīng)體系為模板(cDNA)2y I, Taq DNA polymerase 0.75IU，引物(5，和 3’)I μ M， dNTPsO. 5 μ M,DMSO O. 05 μ I,Mg++2mM,熒光染料 SYBR green O. I μ I, IOx PCR 緩沖液 I μ I, 加MilliQ超純水至終體積10 μ I。由于當(dāng)進(jìn)行人類IVF時，不可能利用較多的受精卵和植入前胚胎期胚胎作基因表達(dá)分析。但可以從單個IVF病例中通過超細(xì)的玻璃吸管提取幾個植入前胚胎期胚胎和單個胚胎細(xì)胞作基因表達(dá)分析以評估此病例IVF胚胎質(zhì)量，確定IVF植入前胚胎的生物學(xué)指標(biāo)。 本專利申請的發(fā)明人已經(jīng)應(yīng)用此方法對目前臨床常用的四種IVF培養(yǎng)液對植入前胚胎期胚胎進(jìn)行了幾個重要轉(zhuǎn)錄子基因表達(dá)分析，此方法為我們今后再確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個重要的監(jiān)測手段。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖I所示為本發(fā)明的一個具體實施例的免疫熒光技術(shù)和Westernblot分析BCL2 和FOS在植入前小鼠胚胎中的表達(dá)；圖2所示為本發(fā)明的一個具體實施例的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析Bcl2和Fos基因在30個胚胎總RNA池內(nèi)的表達(dá)；圖3所示為本發(fā)明的一個具體實施例的利用改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測 Bcl2和Fos基因在單個受精卵和二細(xì)胞期胚胎中的表達(dá)；圖4所示為本發(fā)明的改良實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR用于分析基因在單個細(xì)胞和單個植入前期胚胎表達(dá)的方法的步驟示意圖。
具體實施例方式如圖4所示，根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明利用一種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因在單個細(xì)胞和單個植入前期胚胎的基因表達(dá)方法，以此來進(jìn)行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測，所述利用反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因在單個細(xì)胞和單個植入前期胚胎的基因表達(dá)的步驟包括SI、收集標(biāo)本臨床常規(guī)收集標(biāo)本，經(jīng)過至少三次預(yù)冷的PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌，通過超細(xì)的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細(xì)胞，總?cè)萘繛镺. lyL， 轉(zhuǎn)移到O. 9μ L的RNA抽提液當(dāng)中，所述抽提液為I XPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑，經(jīng)過液態(tài)氮處理后收集全部RNA。S2、收集的 RNA 用 RQlRNase-Free DNase Kit (澳大利亞 Promega 公司生產(chǎn))進(jìn)一步純化。每個胚胎或胚胎細(xì)胞RNA用O. IIURQl RNase-Free DNase，加O. I μ L的緩沖液，經(jīng)過37°C下10分鐘，加O. I μ L終止液，95°C下I分鐘。經(jīng)過這種純化的RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄或儲存在零下80°C備用,最長可儲備至6個月。S3、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),其反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達(dá)中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR體系，所述分析基因表達(dá)方法包括步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR檢測；使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時放大擴(kuò)增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達(dá)量；以及進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；其中在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR檢測步驟中，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)體系如下模板(cDNA) 2 μ 1，Taq DNApolymerase O. 75IU，引物 I μ Μ, dNTPs O. 5 μ M, DMSO 0·05μ l，Mg++2mM，熒光染料 SYBR green O. I μ I, IOx PCR 緩沖液 I μ 1，加 MilliQ 超純水至終體積10 μ I。
全文摘要
本發(fā)明提出一種反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達(dá)中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR體系。所述分析基因表達(dá)方法包括步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR檢測；使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時放大擴(kuò)增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達(dá)量；以及進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。本發(fā)明還提供了反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR檢測的PCR體系。這種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)非常敏感，高度精確，同時能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補(bǔ)Microarray的不足，對分析單個關(guān)鍵基因在單個細(xì)胞的表達(dá)和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價值。此方法為確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個重要的監(jiān)測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102586416SQ201110362859
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者虞強(qiáng) 申請人:江蘇邁健生物科技發(fā)展有限公司