專利名稱：反轉錄pcr分析ivf單個植入前胚胎的基因表達的標本收集方法
技術領域：
本發明涉及一種IVF單個植入前胚胎的基因表達分析方法，特別涉及以一種利用改良實時定量反轉錄PCR技術分析IVF單個植入前胚胎的基因表達方法中的標本收集方法。
背景技術：
1978年7月25日，世界上第一個成功的“試管”嬰孩(IVF，體外受精)路易絲喜悅布朗，在英國出生。從此，IVF為全球超過占10%的不孕癥夫婦帶來了福音。發明IVF的英國科學家羅伯特愛德華茲教授被授予2010年諾貝爾醫學生理學獎。然而，三十多年的臨床實踐并沒有顯著提高IVF的成功率。如，2011年，美國妊娠協會統計35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而嬰兒出生率更低。其中一個重要的原因是IVF胚胎培養液的質量。這是IVF胚胎質量最重要的決定性因素之一。目前，選擇植入母體的囊胚期胚胎主要是根據胚胎的形態學特性。而迄今尚未有一種特殊的生物學標記及監測手段來確定培養液和胚胎質量。胚胎質量與胚胎學家的經驗密切相關。這種人為的選擇實際上存在潛在的危險性。因為即使有優良形態學特性的胚胎仍可能存在基因突變和缺陷。如Sirtuins蛋白通過調節線粒體能量代謝功能，在IVF植入前胚胎期發揮了重要的作用。Sirt3基因的缺陷誘導了腫瘤抑制蛋白trp53的表達而抑制了胚胎的發育。如果sirt3基因和trp53基因同時缺陷，可改善胚胎的發育。這種情況也可見于單獨trp53基因缺陷時，而胚胎表現為正常的形態學特性。在利用實時定量反轉錄 PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chainsreaction)方法檢測小鼠受精卵體外培養72-96小時后的胚胎發現一組胚胎中總的腫瘤抑制基因trp53 mRNA總量明顯低于體內生長的同期胚胎。RNA微陣列(RNA Microarray)也顯示小鼠一組 IVF囊胚期胚胎明顯比體內生長的囊胚期胚胎表達了低的trp53mRNA。目前尚未知道這組胚胎中有多少個胚胎不表達trp53，如果這個trp53基因缺陷的胚胎植入至母體，下一代的腫瘤發生率無疑將大大增高。Microarray顯示小鼠受精卵體外在Whitten氏培養液和 KSOM+氨基酸培養液培養96小時所形成的囊胚期胚胎分別有114和29個基因表達異常。 我們對目前臨床常用的三種IVF培養液中生長成的小鼠囊胚期胚胎的分析顯示52-102個基因表達異常，異常程度非常不同，而且影響了許多關鍵的細胞功能和重要器官的發育。例如1.決定干細胞潛能性的轉錄因子，Nanog和UTFl ；2.干細胞分裂和維持功能；3.心室肌細胞的發育，肺泡細胞的發育，大腦皮層神經元的分化和突觸的發育；4. B淋巴細胞的分化；5.細胞對DNA損傷的反應；6.細胞清除極低密度脂蛋白的能力，等等。這說明目如臨床常用IVF培養液可能存在缺陷，也就是說迄今我們尚未有最理想的IVF培養液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段來監測IVF培養液的質量。雖然微陣列(MiciOarray)分析提供了強有力的工具來分析單一實驗過程中成千上萬個基因的表達。然而它并不適合于樣品的RNA量相當小的時候(對于Microarray,通常每個樣品至少需要50ng RNA，我們的經驗需要100個以上囊胚期胚胎)。這不可能用人類單個IVF病例的100個囊胚期胚胎作Microarray分析,換句話說,Microarray目前并不能作為人類檢測IVF胚胎的基因表達的手段。另一種重要的情況是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表達形式差別很大，尤其當被測基因的RNA轉錄子的豐度低，而且它的轉錄子壽命又較短，而這種特性可能在調節植入前胚胎期功能發揮了關鍵的作用，這種瞬時表達的基因用Microarray分析技術也不易監測到。

發明內容
為解決RNA Microarray在基因表達分析中的不足，本發明提供了一種改良的實時定量反轉錄PCR，這是一種有效的用于分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎表達的方法。這種改良的實時定量反轉錄PCR技術操作要求相當高，但非常敏感，高度精確，同時能產生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補Microarray的不足，對分析單個關鍵基因在單個細胞的表達和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應用價值。這種技術還提供了有效的方法去檢測那些潛在重要的瞬時表達的RNA轉錄子，和怎樣估價并且解釋在總RNA池完成的基因表達分析的結果，不至于掩蓋那些相對穩定表達的轉錄子的重要信息。為達到本發明的目的，本發明建立的實時定量反轉錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達方法包括以下步驟標本收集及純化；反轉錄反應；反轉錄陰性對照和陽性對照；反轉錄產物進行實時定量PCR檢測； 使用組織細胞RNA進行優化PCR條件；在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及進行統計學分析。本發明還提出了利用實時定量反轉錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達方法中的標本收集方法，其包括臨床常規收集標本，經過至少三次預冷的PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌；通過超細的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細胞，總容量為O. I μ L，轉移到O. 9μ L的RNA抽提液當中；以及經過液態氮處理后收集全部RNA。其中， 所述抽提液為I XPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑。由于當進行人類IVF時，不可能利用較多的受精卵和植入前胚胎期胚胎作基因表達分析。但可以從單個IVF病例中通過超細的玻璃吸管提取幾個植入前胚胎期胚胎和單個胚胎細胞作基因表達分析以評估此病例IVF胚胎質量，確定IVF植入前胚胎的生物學指標。 本專利申請的發明人已經應用此方法對目前臨床常用的四種IVF培養液對植入前胚胎期胚胎進行了幾個重要轉錄子基因表達分析，此方法為我們今后再確定新的IVF和體外胚胎培養培養液的條件提供了一個重要的監測手段。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖I所示為本發明的一個具體實施例的免疫熒光技術和Westernblot分析BCL2 和FOS在植入前小鼠胚胎中的表達；圖2所示為本發明的一個具體實施例的實時定量反轉錄PCR分析Bcl2和Fos基因在30個胚胎總RNA池內的表達；圖3所示為本發明的一個具體實施例的利用改良的實時定量反轉錄PCR技術檢測 Bcl2和Fos基因在單個受精卵和二細胞期胚胎中的表達；圖4所示為本發明的改良實時定量反轉錄PCR用于分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎表達的方法的步驟示意圖。
具體實施例方式如圖4所示，根據本發明的目的，本發明利用一種改良的實時定量反轉錄PCR分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎的基因表達方法，以此來進行IVF胚胎培養液的質量監測，所述利用反轉錄PCR分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎的基因表達的步驟包括SI、收集標本臨床常規收集標本，經過至少三次預冷的PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌，通過超細的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細胞，總容量為O. lyL， 轉移到O. 9μ L的RNA抽提液當中，所述抽提液為I XPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑，經過液態氮處理后收集全部RNA。S2、收集的 RNA 用 RQlRNase-Free DNase Kit (澳大利亞 Promega 公司生產)進一步純化。每個胚胎或胚胎細胞RNA用O. IIURQ IRNase-Free DNase，加O. I μ L的緩沖液，經過37°C下10分鐘，加O. I μ L終止液，95°C下I分鐘。經過這種純化的RNA可直接用于反轉錄或儲存在零下80°C備用,最長可儲備至6個月。S3、進行反轉錄反應,其反應體系如下
SS1.3 μΙ
反轉錄酶2.5 U
隨機引物2.5μΜ
dNTPs0.5μΜ Mg++4 mM
RNase抑制劑0.2 U
IOxPCR 緩沖液 0.4μΙ加特殊處理過的Mi 11 i Q水至終體積4 μ I其中，反轉錄反應條件如下
權利要求
1.一種反轉錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達中的標本收集方法，所述分析基因表達方法包括步驟標本收集；反轉錄反應；反轉錄陰性對照和陽性對照；反轉錄產物進行實時定量PCR檢測；使用組織細胞RNA進行優化PCR條件；在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及進行統計學分析； 其中所述標本收集的步驟包括臨床常規收集標本，經過至少三次預冷的PBS溶液洗滌；通過超細的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細胞，總容量為0. I y L，轉移到0. 9 ii L的RNA抽提液當中；以及經過液態氮處理后收集全部RNA ；其中，所述抽提液為IXPCR緩沖液中加入0. IIU RNA酶抑制劑。
2.如權利要求I所述的反轉錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達中的標本收集方法，其中進一步包括將收集的RNA用RQl RNase-Free DNase進一步純化，每個胚胎或胚胎細胞RNA用0. IIU RQl RNase-Free DNase,加0. I u L的緩沖液；經過37。。下10分鐘，加0. I u L終止液，95°C 下I分鐘。
3.如權利要求I所述的反轉錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達中的標本收集方法，其中進一步包括將經過純化的RNA儲存在零下80°C備用。
全文摘要
本發明提出一種改良實時定量反轉錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達的標本收集方法，所述分析基因表達方法包括步驟標本收集；反轉錄反應；反轉錄陰性對照和陽性對照；RT產物進行實時定量PCR檢測；使用組織細胞RNA進行優化PCR條件；在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及進行統計學分析。所述的標本收集方法包括臨床常規收集標本以及標本純化的步驟。這種改良的實時定量反轉錄PCR技術非常敏感，高度精確，同時能產生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補Microarray的不足，對分析單個關鍵基因在單個細胞的表達和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應用價值。此方法為確定新的IVF和體外胚胎培養培養液的條件提供了一個重要的監測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102586415SQ20111036284
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者虞強 申請人:江蘇邁健生物科技發展有限公司