專利名稱：檢測肉牛早熟性的引物及其方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測肉牛早熟性的引物及其方法與應用。
背景技術：
青春期啟動在家畜繁殖研究中占有重要地位，與其繁殖力和生長發育有著密切的 關聯性。哺乳動物的青春期啟動以及繁衍后代的行為是從下丘腦神經細胞分泌的脈沖性 GnRH(促性腺激素釋放激素)開始的，而GnRH的分泌由一系列上游作用因子所調控。研究 證實，GPR54基因在下丘腦、垂體和胎盤等多種組織中表達，在青春期的下丘腦表達量最大， 并隨動情周期呈現周期性的變化。GPR54通過與kissp印tin結合后，活化GnRH的表達，進 而打開下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸，啟動青春期發育。在進化過程中所形成的性早熟特 性能夠穩定的遺傳，如能發現控制早熟性狀的主效基因，或與之緊密連鎖的分子標記，則對 加快動物的繁殖力和生長發育性狀的育種進程具有重要的意義。目前，雜交改良是牛的育種，尤其是肉牛育種的主要手段，工作時間長，效果緩慢; 選種方法主要是常規育種，突破牛的單胎特性還沒有可能性，由于缺少合適的遺傳標記，應 用分子育種解決育種難題則相當困難。

發明內容
本發明的目的是提供一種可用于檢測肉牛早熟性的引物及其方法與應用。本發明所提供的檢測肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列 2所示。本發明所提供的檢測肉牛早熟性的方法，是以待測牛基因組DNA為模板，以序列 表中序列1和序列2所示的DNA分子為引物，進行PCR擴增，Mae II和Nla IV限制性內切酶 分別酶切PCR擴增產物，檢測Mae II和Nla IV限制性內切酶酶切產物的大小；當Mae II酶切后的PCR產物含有兩條臨近的DNA片段，大小都在100 200bp ； Nla IV酶切后的PCR產物含有兩條DNA片段，大小分別在100 200bp、200 300bp，待測 牛為GPR973-CC-TT基因型；當Mae II酶切后的PCR產物含有三條DNA片段，其中兩個片段的大小都在100 200bp，另一片段的大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的PCR產物含有三條DNA片段，大小 分別在 100 200bp、200 300bp、300 400bp，待測牛為 GPR973-CT-TC 基因型；當Mae II酶切后的PCR產物含有一條DNA片段，大小在300 400bp ；Nla IV酶切 后的PCR產物含有一條DNA片段，大小在300 400bp，待測牛為GPR973-TT-CC基因型。所述GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC 基因型牛早熟。本發明的檢測牛早熟性的方法，其中所述檢測Mae II和NlaIV限制性內切酶酶切 產物的大小的方法為瓊脂糖凝膠電泳。本發明所提供的培育肉牛的方法，是用所述檢測肉牛早熟性的方法，獲得GPR973-CC-TT基因型的牛，以所述GPR973-CC-TT基因型的牛為親本進行育種獲得牛。本發明檢測肉牛早熟性的方法，能通過簡單的PCR擴增和酶切確定待測牛的基因 型，GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC基因型牛早 熟。以GPR973-CC-TT基因型的牛進行育種可獲得候選的早熟的肉牛品系。


圖1為Mae II限制性內切酶酶切PCR產物后的圖譜。圖2為Nla IV限制性內切酶酶切PCR產物后的圖譜。
具體實施例方式一、鑒定 GPR973-T/T-C/C 基因型提取西門塔爾牛、安徽地方黃牛牛基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板， GPR973S和GPR973A為引物進行PCR擴增，引物GPR973S和GPR973A的核苷酸序列如下GPR973S 5‘ GGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG 3‘GPR973A 5‘ TCAACCTTCCCAAGACTCTGATGC 3‘PCR擴增體系總體系 25 μ L，10 μ M/L TPS 1· 0 μ L，10 μ M/L TPA, l.OyL 10XPCR 緩沖液 2. 5 μ L, 2mM/L dNTPs 2. 0 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L, IOOng/ μ L 模板 1.0 μ L，其余用超純水補齊。PCR 擴增條件 95°C預變性 5min ；95°C變性 45s，65°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個 循環，最后72°C延伸5min，4°C保存。用Mae II和Nla IV限制性內切酶分別對PCR產物進行酶切。15yL酶切反應體系=IOOng PCR產物，5U的Mae II或Nla IV限制性內切酶，1. 5 μ L 的IOX緩沖液，加超純水至15 μ L。37°C過夜消化，3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀分析和拍照，統計基因型。凝膠成像結果如圖1所示Mae II酶切后的PCR產物I，在瓊脂糖凝膠上呈現兩條條帶，兩條帶的大小都在 100 200bp (精確為157bp和184bp)，該牛為CC基因型(圖1的泳道1) ；PCR產物經過測
序與預期結果一致；Mae II酶切后的PCR產物II，在瓊脂糖凝膠上呈現三條條帶，其中兩條帶的大小 都在100 200bp(精確為157bp和184bp)，另外一條帶的大小在300 400bp(精確為 341bp)，該牛為CT基因型(圖1的泳道2) ；PCR產物經過測序與預期結果一致；Mae II酶切后的PCR產物III，在瓊脂糖凝膠上呈現一條帶，該帶的大小在300 400bp(精確為341bp)，該牛為TT基因型(圖1的泳道3) ；PCR產物經過測序與預期結果一 致。Nla IV酶切后的PCR產物I，在瓊脂糖凝膠上呈現兩條條帶，兩條帶的大小分別在 100 200bp (精確為123bp) ,200 300bp (精確為218bp)，該牛為TT基因型(圖2的泳 道1) ；PCR產物經過測序與預期結果一致。Nla IV酶切后的PCR產物III，在瓊脂糖凝膠上呈現一條條帶，條帶大小在300 400bp(精確為341bp)，該牛為CC基因型(圖2的泳道2) ；PCR產物經過測序與預期結果一
4致。Nla IV酶切后的PCR產物II，在瓊脂糖凝膠上呈現三條條帶，三條帶的大小分別在 100 200bp (精確為 123bp)、200 300bp (精確為 218bp)、300 400bp (精確為 341bp)， 該牛為TC基因型(圖2的泳道3) ；PCR產物經過測序與預期結果一致。Mae II酶切CC型，Nla IV酶切為TT型，該牛為GPR973_CC_TT基因型；Mae II酶切TT型，Nla IV酶切為CC型，該牛為GPR973-TT-CC基因型；Mae II酶切CT型，Nla IV酶切為TC型，該牛為GPR973-CT-TC基因型。二、GPR973-T/T-C/C基因型與牛早熟性的相關性西門塔爾牛和荷斯坦牛共78頭，南陽牛、安徽地方黃牛共103頭，南陽牛和安徽地 方黃牛雜交2代113頭，用步驟(一)的方法鑒定基因型，同時統計初情期，結果見表1。表1不同基因型牛的基因型頻率及其與早熟性之關聯性 表1中“未檢測到”是指所檢測牛中未發現該基因型表明GPR973-CC-TT基因型牛的初情期顯著早于GPR973-CT-TC基因型和 GPR973-TT-CC基因型(P < 0. 01)，在實際的肉牛育種中，選擇GPR973-CC-TT基因型的牛進 行育種可獲得候選的早熟型的肉牛品系。以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進 行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方 案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
權利要求
檢測肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。
2.檢測肉牛早熟性的方法，是以待測牛基因組DNA為模板，以序列表中序列1和序列2 所示的DNA分子為引物，進行PCR擴增，Mae II和Nla IV限制性內切酶分別酶切PCR擴增產 物，檢測Mae II和Nla IV限制性內切酶酶切產物的大小；當Mae II酶切后的PCR產物含有兩條臨近的DNA片段，大小都在100 200bp ；Nla IV 酶切后的PCR產物含有兩條DNA片段，大小分別在100 200bp、200 300bp，待測牛為 GPR973-CC-TT 基因型；當Mae II酶切后的PCR產物含有三條DNA片段，其中兩個片段的大小都在100 200bp，另一片段的大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的PCR產物含有三條DNA片段，大小 分別在 100 200bp、200 300bp、300 400bp，待測牛為 GPR973-CT-TC 基因型；當Mae II酶切后的PCR產物含有一條DNA片段，大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的 PCR產物含有一條DNA片段，大小在300 400bp，待測牛為GPR973-TT-CC基因型。所述GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC基因 型牛早熟。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述檢測MaeII和Nla IV限制性內切酶 酶切產物的大小的方法為瓊脂糖凝膠電泳。
4.培育肉牛的方法，是用權利要求2或3所述的方法檢測牛，獲得GPR973-CC-TT基因 型的牛，以所述GPR973-CC-TT基因型的牛為親本進行育種獲得牛。
全文摘要
本發明公開了一種檢測肉牛早熟性的引物及其方法與應用，檢測肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。檢測牛早熟性的方法，是以待測牛基因組DNA為模板，以序列表中序列1和序列2所示的DNA分子為引物，進行PCR擴增，Mae Ⅱ和NlaⅣ限制性內切酶分別酶切PCR擴增產物，檢測Mae Ⅱ和NlaⅣ限制性內切酶酶切產物的大小；本發明檢測牛早熟性的方法，能通過簡單的PCR擴增和酶切確定待測牛的基因型，以GPR973-CC-TT基因型的牛進行育種可獲早熟的肉牛品系。
文檔編號C12Q1/68GK101914616SQ20101019694
公開日2010年12月15日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者陳華, 陳宏權 申請人:安徽農業大學