專利名稱：一種利用乳清發酵生產丁二酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，主要涉及一種利用廉價的乳清原料發酵生產丁二 酸的方法。
背景技術：
丁二酸，又稱琥珀酸，是一種常見的天然有機酸，廣泛的存在于人體、動物、植物、 微生物中。丁二酸是一種重要的化學品，可用于表面活性劑、清潔劑、溶劑等領域，在食品行 業可作為PH改良劑、風味劑或抗菌劑，也可用作動物飼料添加劑或植物助長劑等。在工業 上，丁二酸是一種重要的碳四平臺化合物，可以轉化為很多重要的化學品，如脂肪酸、四氫 呋喃、1，4_ 丁二醇、丁內酯等，還可以作為單體用來合成生物可降解材料PBS。目前已 有超過250種以苯為原料的化工產品可以通過丁二酸轉化獲得，因此丁二酸的市場需求不 斷增加。傳統生產方法采用丁烷經順丁烯二酸酐通過電解生產，污染大、轉化率低、成本高， 嚴重抑制了琥珀酸的發展潛力。采用生物法制備丁二酸，與傳統的化學法相比，具有環境友好性、循環利用 資源、固定co2氣體等諸多優點，對緩解當今社會能源短缺和環境污染具有重大戰略 意義。目前，生物法生產琥珀酸和它大多數衍生物的合成還處在進一步研究和開發 階段。生物法制備琥珀酸的微生物主要有從牛瘤胃中篩選出的產琥珀酸放線桿菌 (Actinobacillussuccinogenes)和基因工程構建的大腸桿菌(Esherichia coli)，培養基 原料多為葡萄糖。使用低廉價格的碳源是降低琥珀酸發酵成本的關鍵因素之一。已有文獻 報道采用乳清為碳源進行丁二酸發酵，但是丁二酸產量最高僅為27. 9g/L，收率57%。

發明內容
本發明的目的在于提供一種綜合利用食品工業廢棄物乳清，采用發酵法生產丁二 酸的方法，使得利用本發明所述的方法可以大大提高丁二酸的產量和收率，達到綜合有效 利用乳清實現丁二酸最大產率的目的。為了實現本發明目的，本發明的技術方案為一種利用乳清發酵生產丁二酸的方法，采用產琥珀酸放線桿菌 Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30 100g/L乳糖的乳清的培養基中發酵產琥珀酸。該技術方案的具體方法是(1)種子培養在100mL血清瓶中進行加入種子培養基為20 80mL，通入N2和C02 的混合氣；冷卻后接入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養；其中，種子培養基(g/L):葡萄糖10(分消)，酵母膏5，NaHC03 10， NaH2P04 2H209. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8，121°C 滅菌 15min ；培養條件為溫度30 40°C，搖床轉速100 200r/min，培養時間10 16h ；(2)發酵產酸在5L發酵罐中加入發酵培養基體積為2 4L，接種量為3 7%(v/v)，溫度為35 40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速 在100 300rpm發酵時間為30 60h。其中，發酵培養基(g/L)乳清(按含乳糖計)30 100，酵母膏0 10，KH2P04 3， MgCl2 6H20 0. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。其中，乳清的最佳配方為70g/L ；酵母膏為6g/L。本發明技術方案中所述的乳清為工業生產奶酪的副產物，經真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。本發明的有益效果在于(1)本發明利用從瘤胃中篩選出的琥珀酸放線桿菌，它也很適宜于發酵乳清原 料，用其發酵乳清生產丁二酸，可有效減少氮源用量，產物濃度高達47. 51g/L，收率高達 67.9%，很適用于低成本丁二酸的工業化生產；(2)本發明突出的優點是利用廉價乳清原料發酵生產丁二酸，乳清作為一種價格 低廉的粗原料可以替代葡萄糖作為碳源用來發酵生產丁二酸，是一種利用可再生原料的生 產方法，可緩解化學合成丁二酸的石化資源緊張問題，對環境友好，并且由于乳清中含有可 供微生物利用的氮源與其他營養成分，因而也能夠顯著減少發酵的培養基成分。說明書附1乳清發酵過程曲線
具體實施例方式本發明不限于所列出的幾個實施例。本發明所使用的菌種琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113(中 國專利菌種，授權公告號為CN100537744C)。本發明所述的乳清為工業生產奶酪的副產物，經真空干燥后含75 80% (w/w)乳 糖。本發明所采用的有機酸的分析方法為高效液相色譜法(HPLC) :HPLC系統高效液相色譜儀，WatersHPLC2010工作站；色 譜柱 Prevail organic acid column 250mmX 4. 6mm ；紫外檢測波長 215nm ；流速 lmL/min， 進量20iiL，流動相25mmol/L KH2P04, pH 2. 5 ；柱溫室溫。重蒸水配制不同濃度的有機酸 (丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))標準溶液，根據峰面積與有 機酸標準溶液的濃度關系制作標準曲線。發酵樣品經離心稀釋后根據峰面積計算各有機酸 含量。本發明所采用的乳糖的分析方法為高效液相色譜法(HPLC)色譜分析柱Bio-red Aminex HPX-87H型離子排斥色 譜柱；檢測器ShoSex RI-101型示差折光檢測器；流動相5mmol/L H2S04溶液；進樣體積 20 ii L。流動相流速0. 6mL/min ；柱溫55°C。實施例1(1)種子培養在100mL血清瓶中進行加入種子培養基為80mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養；培養條件為溫度40°C，搖床轉速200r/min，培養時間16h ；
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(2)發酵產酸在5L發酵罐中加入發酵培養基體積為4L，接種量為7% (v/v)，溫 度為40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速在300rpm發酵 時間為60h。種子培養基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6， K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8。發酵培養基(g/L)乳清(按含乳糖計)30 100，酵母膏10，KH2P04 3， MgCl2 6H200. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。在血清瓶中發酵實驗，使用乳清作為碳源，發酵結果見表1。表1不同初始乳糖濃度對乳清發酵制備丁二酸的影響
初始乳糖濃度(g/L) 丁二酸(g/L)乙酸(g/L)甲酸(g/L)收率(％) 從上表可看出，初始乳糖濃度為70g/L時丁二酸產量最高，達到46. 94g/L，丁二酸 收率為67. 1%0實施例2(1)種子培養在100mL血清瓶中進行加入種子培養基為20mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養；培養條件為溫度30°C，搖床轉速lOOr/min，培養時間10h ；(2)發酵產酸在5L發酵罐中加入發酵培養基體積為2L，接種量為3% (v/v)，溫 度為35°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速在lOOrpm發酵 時間為30h。按實例1的方法，在血清瓶中進行發酵實驗，以真空干燥后的乳清的作為碳源，在 發酵培養基中添加不同濃度的酵母膏，其含量為(g/L) :0g、2g、4g、5g、6g、6.5g、7g、8g、9g、 10g。不同酵母膏濃度對乳清發酵制備丁二酸的影響見表2所示。表2不同酵母膏濃度對乳清發酵制備丁二酸的影響
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由表2可知，當酵母膏濃度在6g/L時，丁二酸產量達到46. 75g/L，繼續增加酵母膏 用量，丁二酸產量基本無變化。實施例3本實施例在生物法制備丁二酸的過程中實現以乳清為碳源，并通過與少量酵母膏 (6g/L)聯用實現菌體發酵制備丁二酸的能力。菌種、具體培養方法同實施例1。初始乳清 70g/L (以乳糖計)。(1)種子培養在100mL血清瓶中進行加入種子培養基為50mL，通入N2和C02的混 合氣；冷卻后接入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養；培養條件為溫度37°C，搖床轉速150r/min，培養時間12h ；(2)發酵產酸在5L發酵罐中加入發酵培養基體積為3L，接種量為5% (v/v)，溫 度為37°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速在180rpm發酵 時間為36h。從附

圖1可看出，以乳清為碳源，菌體生長旺盛，丁二酸產量可達47. 51g/L，收率 為 67. 9%。
權利要求
一種利用乳清發酵生產丁二酸的方法，采用產琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培養基中發酵產琥珀酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的具體方法是(1)種子培養在100mL血清瓶中進行加入種子培養基為20 80mL，通入N2和C02的 混合氣；冷卻后接入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113培養；(2)發酵產酸在5L發酵罐中加入發酵培養基體積為2 4L，接種量為3 7%(v/ v)，溫度為35 40°C，通入含有N2和C02混合氣以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速在 100 300rpm發酵時間為30 60h。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟⑴中種子培養基(g/L)為 葡萄糖 10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8， 121°C 滅菌 15min。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的種子培養條件為溫 度30 40°C，搖床轉速100 200r/min，培養時間10 16h。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發酵培養基(g/L)為 乳清(按含乳糖計)30 100，酵母膏 0 10，KH2P04 3，MgCl2 6H20 0. 3，CaCl20. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發酵培養基中乳清含量 為按含乳糖計70g/L。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中發酵培養基中酵母膏含 量為6g/L。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳清為工業生產奶酪的副產物，經 真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。
全文摘要
本發明涉及一種利用乳清發酵生產丁二酸的方法，采用產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培養基中發酵產琥珀酸。本發明利用從瘤胃中篩選出的琥珀酸放線桿菌，它也很適宜于發酵乳清原料，用其發酵乳清生產丁二酸，可有效減少氮源用量，產物濃度高達47.51g/L，收率高達67.9％，很適用于低成本丁二酸的工業化生產；本發明突出的優點是利用廉價乳清原料發酵生產丁二酸，乳清作為一種價格低廉的粗原料可以替代葡萄糖作為碳源用來發酵生產丁二酸，是一種利用可再生原料的生產方法，可緩解化學合成丁二酸的石化資源緊張問題，對環境友好，并且由于乳清中含有可供微生物利用的氮源與其他營養成分，因而也能夠顯著減少發酵的培養基成分。
文檔編號C12P7/46GK101857888SQ201010205810
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者奚永蘭, 姜岷, 方曉江, 李建, 楊卓娜, 鄭曉宇, 韋萍, 馬江峰 申請人:南京工業大學