專利名稱：一種結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液的脫蛋白方法，尤其涉及一種微生物多糖結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法。
背景技術(shù)：
結(jié)冷膠是由少動(dòng)鞘氨醇單胞菌產(chǎn)生的一種新型微生物多糖，具有可再生性、良好的兼容性、熱穩(wěn)定性、pH范圍寬、耐酸、抗酶解、用量低和香氣釋放性強(qiáng)等獨(dú)特性能，在食品、制藥、日化等工業(yè)中具有廣泛的用途。由于其具有優(yōu)于黃原膠、卡拉膠和海藻酸鈉等凝膠劑的特性，成為微生物多糖研究的又一熱點(diǎn)。
但是，在應(yīng)用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌發(fā)酵生產(chǎn)微生物多糖結(jié)冷膠的過程中，由于結(jié)冷膠特殊的流體力學(xué)性質(zhì)給其工業(yè)化生產(chǎn)帶來諸多的工程問題，結(jié)冷膠發(fā)酵液脫蛋白便是其中最難解決的問題之一。結(jié)冷膠發(fā)酵液的高粘度、高雜質(zhì)與低濃度的特性給脫蛋白造成極大的困難，成為直接決定結(jié)冷膠的質(zhì)量與生產(chǎn)成本的關(guān)鍵工序。因此，如何有效地脫除結(jié)冷膠發(fā)酵液中的蛋白，降低結(jié)冷膠的提取成本，建立操作簡單、易于放大的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，是目前微生物多糖脫蛋白工藝迫切需要研究和開發(fā)的。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種成本低、操作簡單、易于放大并綠色環(huán)保的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法。利用該方法可以獲得高品質(zhì)的結(jié)冷膠。
本發(fā)明的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其特征在于，所述發(fā)酵液的預(yù)處理方法是將發(fā)酵液升溫至85-95℃，維持10-30分鐘后再降至80℃；所述脫酰基處理方法是將預(yù)處理后的發(fā)酵液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH值至9-12，維持10-30分鐘，然后用1M的鹽酸調(diào)pH值至中性；所述酶法脫蛋白處理方法是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.36AU g-1～0.96AU g-1的堿性蛋白酶，然后在pH 6-10，40℃-65℃條件下，反應(yīng)1-6小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
其中，所述發(fā)酵液優(yōu)選是應(yīng)用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJCCTCC No.M206058發(fā)酵產(chǎn)生的微生物多糖結(jié)冷膠發(fā)酵液。
其中，所述發(fā)酵液的預(yù)處理方法優(yōu)選是將發(fā)酵液升溫至90℃，維持20分鐘后再降至80℃。
其中，所述脫酰基處理方法優(yōu)選是將預(yù)處理后的發(fā)酵液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH值至10，維持20分鐘，然后用1M的鹽酸調(diào)pH值至中性。
其中，所述酶法脫蛋白處理方法優(yōu)選是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.43AUg-1～0.66AU g-1的堿性蛋白酶，然后在pH 7-9，50℃-60℃條件下，反應(yīng)3-6小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
上述酶法脫蛋白處理方法最優(yōu)選是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.5AL g-1的堿性蛋白酶，然后在pH 8-9，55℃條件下，反應(yīng)4小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
應(yīng)用上述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，處理后的結(jié)冷膠的含氮量為0.1-0.25％。達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著技術(shù)進(jìn)步在于1)本發(fā)明的脫蛋白工藝簡單、易于放大。
2)本發(fā)明的方法中能耗低，原材料消耗少，生產(chǎn)成本大大降低，且符合綠色環(huán)保的要求。
3)產(chǎn)品含氮量小于0.3％，可以達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1結(jié)冷膠的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其中脫蛋白方法中各工藝步驟和工藝條件是(1)菌種選擇選用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下，培養(yǎng)20小時(shí)；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，在無菌條件下用接種環(huán)接3環(huán)于100mL種子液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，制得一級種子液(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子液于500mL種子液體培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，制得二級種子液；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為6％的接種量，接二級種子液于50L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、pH 7.0條件下，通風(fēng)1.3vvm，培養(yǎng)50小時(shí)；(6)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(5)之發(fā)酵液粘度達(dá)15000cP時(shí)，收集發(fā)酵液，即為結(jié)冷膠粗多糖粗品，結(jié)冷膠粗多糖濃度為18g/L。
上述步驟(3)、(4)中所述種子液體培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.0；步驟(2)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述步驟(5)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，NaHPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.0。
(7)發(fā)酵液的預(yù)處理將步驟(6)所述發(fā)酵液升溫至90℃，維持20分鐘后再降至80℃。
(8)脫酰基處理將預(yù)處理后的發(fā)酵液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH值至10，維持20分鐘，然后用1M的鹽酸調(diào)pH值至中性。
(9)酶法脫蛋白處理向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.5AU g-1的堿性蛋白酶，然后在pH 9，55℃條件下，反應(yīng)4小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
測得結(jié)冷膠的含氮量為0.1％(質(zhì)量百分比)，達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例2結(jié)冷膠的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其中脫蛋白方法中各工藝步驟和工藝條件是(1)菌種選擇選用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在25℃條件下，培養(yǎng)24小時(shí)；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL種子液體培養(yǎng)基中，在25℃條件下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，制得一級種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以體積比為8％的接種量，接一級種子液于500mL種子液體培養(yǎng)基中，25℃條件下，振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，制得二級種子液；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為6％的接種量，接二級種子液于10L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、pH 6.8條件下，通風(fēng)1.0vvm，培養(yǎng)56小時(shí)；(6)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(5)之發(fā)酵液粘度達(dá)12000cP時(shí)，收集發(fā)酵液，即為結(jié)冷膠粗多糖粗品，結(jié)冷膠粗多糖濃度為16g/L；上述步驟(3)、(4)中所述種子液體培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 6.8；步驟(2)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.5％的瓊脂粉。
上述步驟(5)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH6.8；(7)發(fā)酵液的預(yù)處理將步驟(6)所述發(fā)酵液升溫至85℃，維持30分鐘后降至80℃；(8)脫酰基處理將步驟(7)預(yù)處理后的發(fā)酵液調(diào)pH值9，維持30分鐘，然后調(diào)pH值至中性；(9)酶法脫蛋白處理向步驟(8)中的發(fā)酵液中加入堿性蛋白酶，比例為每升發(fā)酵液加入0.48AU的堿性蛋白酶，在pH6、40℃下，反應(yīng)6小時(shí)；采用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量為0.25％(質(zhì)量百分比)，達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3結(jié)冷膠的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其中脫蛋白方法中各工藝步驟和工藝條件是(1)菌種選擇選用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在33℃條件下，培養(yǎng)18小時(shí)；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，在無菌條件下用接種環(huán)接4環(huán)于100mL種子液體培養(yǎng)基中，在33℃條件下，振蕩培養(yǎng)9小時(shí)，制得一級種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以體積比為10％的接種量，接一級種子液于1000mL種子液體培養(yǎng)基中，33℃條件下，振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，制得二級種子液；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為10％的接種量，接二級種子液于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，33℃、pH 7.2條件下，通風(fēng)1.5vvm，培養(yǎng)40小時(shí)；(6)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(5)之發(fā)酵液粘度達(dá)13000cP時(shí)，收集發(fā)酵液，即為結(jié)冷膠粗多糖粗品，結(jié)冷膠粗多糖濃度為17g/L；上述步驟(3)、(4)中所述種子液體培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.2；步驟(2)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為2.0％的瓊脂粉；上述步驟(5)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.2；(7)發(fā)酵液的預(yù)處將步驟(6)所述發(fā)酵液升溫至90℃，維持15分鐘后降至80℃；(8)脫酰基處理將步驟(7)預(yù)處理后的發(fā)酵液調(diào)pH值10，維持20分鐘，然后調(diào)pH值至中性；(9)酶法脫蛋白處理向步驟(8)中的發(fā)酵液中加入堿性蛋白酶，比例為每升發(fā)酵液加入0.80AU的堿性蛋白酶，在pH7.5、55℃下，反應(yīng)4小時(shí)；采用凱氏定氮法測定處理后結(jié)冷膠的含氮量為0.13％，達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例4結(jié)冷膠的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其中脫蛋白方法中各工藝步驟和工藝條件是(1)菌種的選擇選用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCCNo.M206058；(2)斜面培養(yǎng)將上述步驟(1)的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，在30℃下，培養(yǎng)20小時(shí)；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，在無菌條件下用接種環(huán)接4環(huán)100mL種子液體培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于種子液體培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，30℃、pH 7.0條件下，通風(fēng)1.2vvm，培養(yǎng)48小時(shí)；(6)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(5)之發(fā)酵液粘度達(dá)12500cP時(shí)，收集發(fā)酵液，即為結(jié)冷膠粗多糖粗品，結(jié)冷膠粗多糖濃度為16.4g/L；上述步驟(3)、(4)中所述種子液體培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.2；步驟(2)所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.8％的瓊脂粉；上述步驟(5)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(1L蒸餾水計(jì))為葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.2；(7)發(fā)酵液的預(yù)處理將步驟(6)所述發(fā)酵液升溫至95℃，維持10分鐘后降至80℃；(8)脫酰基處理將步驟(7)預(yù)處理后的發(fā)酵液調(diào)pH值12，維持10分鐘，然后調(diào)pH值至中性；(9)酶法脫蛋白處理向步驟(8)中的發(fā)酵液中加入堿性蛋白酶，比例為每升發(fā)酵液加入0.96AU的堿性蛋白酶，在pH10、65℃下，反應(yīng)1小時(shí)；采用凱氏定氮法測定處理后結(jié)冷膠的含氮量為0.20％，達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，包括發(fā)酵液預(yù)處理、脫酰基處理、酶法脫蛋白處理；其特征在于，所述發(fā)酵液的預(yù)處理方法是將發(fā)酵液升溫至85-95℃，維持10-30分鐘后再降至80℃；所述脫酰基處理方法是將預(yù)處理后的發(fā)酵液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH值至9-12，維持10-30分鐘，然后用1M的鹽酸調(diào)pH值至中性；所述酶法脫蛋白處理方法是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.36AUg-1～0.96AUg-1的堿性蛋白酶，然后在pH 6-10，40℃-65℃條件下，反應(yīng)1-6小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，其特征在于，所述發(fā)酵液是應(yīng)用少動(dòng)鞘氨醇單孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058發(fā)酵產(chǎn)生的微生物多糖結(jié)冷膠發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，其特征在于，所述發(fā)酵液的預(yù)處理方法是將發(fā)酵液升溫至90℃，維持20分鐘后再降至80℃。
4.如權(quán)利要求1所述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，其特征在于，所述脫酰基處理方法是將預(yù)處理后的發(fā)酵液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH值至10，維持20分鐘，然后用1M的鹽酸調(diào)pH值至中性。
5.如權(quán)利要求1所述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，其特征在于，所述酶法脫蛋白處理方法是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.43AUg-1～0.66AUg-1的堿性蛋白酶，然后在pH 7-9，50℃-60℃條件下，反應(yīng)3-6小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，其特征在于，所述酶法脫蛋白處理方法是向脫酰基處理后的發(fā)酵液中加入0.5AUg-1的堿性蛋白酶，然后在pH 8-9，55℃條件下，反應(yīng)4小時(shí)，用凱氏定氮法測定處理后的結(jié)冷膠的含氮量確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫蛋白方法，包括(1)發(fā)酵液的預(yù)處理，(2)發(fā)酵液脫酰基處理，(3)發(fā)酵液酶法脫蛋白處理等步驟；本發(fā)明方法有效地解決了目前微生物多糖后提取工藝中脫蛋白操作的瓶頸問題，具有工藝操作簡單，操作條件溫和，能耗低、原材料消耗少，提取成本低，易于放大等優(yōu)點(diǎn)，且該工藝符合綠色工藝的要求，產(chǎn)品的含氮量達(dá)到美國食品與農(nóng)業(yè)管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C12R1/01GK1932026SQ20061006878
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者許平, 王霞, 馬翠卿 申請人:山東大學(xué)