專利名稱：一種高效固氮微生物誘變育種方法
技術領域：
本發明涉及微生物誘變育種領域，具體地，涉及一種固氮微生物誘變育種方法。
背景技術：
固氮菌是指能夠自由生活并將空氣中的氮氣固定成可被植物利用的有效氮的微 生物。以固氮微生物制成的微生物促生肥料，目前已廣泛應用于農業生產中，無毒無害，不 污染環境，增產作用明顯，增產幅度一般達5% 17.9%，施用于有效氮較低的耕作土壤內 增產效果達22. 34%。國內外都在積極研究和開發應用。我國的固氮微生物肥料生 產應用已有近50年的歷史，取得了良好的經濟效益。作為固氮菌肥料生產和應用的基礎， 高效固氮菌株的選育是固氮菌肥料研制和開發最重要的步驟。但野生固氮菌株的固氮能力 往往較弱，達不到有效促生的目的。目前，高效固氮微生物誘變選育常采用紫外線輻照誘變、化學誘變等方法，其缺陷 在于存在一定的危險性，對操作人員的身體可能造成嚴重傷害，且選育出的高效菌株易產 生回復突變，遺傳性狀常不穩定。而高能粒子束及激光束照射誘變的方法則成本較高，其具 體操作也受設備條件和人員技術水平的影響，優良菌株的選育效率受到限制和弱化。因此 如何提高高效固氮微生物的選育效率，一直都是科研機構和菌劑研發部門研究的重點。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的上述缺陷，提出一種安全清潔、設備簡單、廉價 高效的固氮微生物誘變育種方法，可以提高高效固氮微生物的育種效率和降低育種成本。實現上述目的的技術方案如下一種高效固氮微生物誘變育種方法，包括固氮微生物的誘變處理、篩選及多代定 向選擇，所述誘變處理是采用2400 2500MHz、中心波長122mm的微波輻照處理固氮微生物 培養液，輻照功率為100W 1050W，照射時間為5s 240s。本發明主要是采用2400 2500MHz、中心波長122mm的微波對固氮微生物培養液 和純菌體培養物輻照處理一定時間。這一特定波長的微波能對固氮微生物某些特定DNA片 段發生誘變作用，引起菌株固氮能力的遺傳變異，用2450MHz的微波輻射誘變處理效果最 好。進一步地，所述固氮微生物培養液在600nm時的OD值為0. 5及以上。進一步地，所述固氮微生物為苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)，微波輻照功率 為800W，照射時間為12s。進一步地，所述固氮微生物為圓褐固氮菌(Azotobocter chroococcum)，微波輻照 功率為150W，照射時間為178s，或輻照功率為100W，照射時間為240s。進一步地，所述固氮微生物為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，微波輻照功率為 250W，照射時間為36s。進一步地，所述固氮微生物為紅豆草根瘤菌(Rhizobium)，微波輻照功率為1050W，照射時間為5s。上述不同的固氮微生物，在以上特定的輻照功率、照射時間參數下，正突變率均達
到最高。進一步地，在本發明中，所述篩選的步驟為將經微波輻照誘變處理后的固氮微生 物的菌懸液涂布于Winogradsky無氮固體培養基上培養，選擇菌落生長直徑明顯大于原始 菌株的突變株，后采用乙炔還原法完成純培養物的固氮酶活性定量測定，初步得到優良的 突變株。其中Winogradsky無氮固體培養基的配置方法如下培養基母液配制=KH2PO4(50. Og/L)，MgSOJH2O (25. Og/L)，NaCl (25. Og/L)， FeS047H20(l. Og/L)，Na2Mo042H20 (1. 0g/L)，MnS044H20(l. 0g/L)，加 1000ml 蒸餾水溶解后以 IM NaOH調節pH為7. 2，5ml培養基母液用10g/L的甘露醇溶液定容至1000ml，加入CaCO3 粉末(0. lg/L)，以2M H2SO4調pH值為6. 2。固體培養基經0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后添加 瓊脂15g/L，調節pH值為6. 8后高溫高壓滅菌。進一步地，在本發明中，所述多代定向選擇的步驟為將經篩選得到的突變株培養 液施入栽培植物根部以驗證突變株的促生效果，對固氮酶活性和植物促生效果均顯著強于 出發菌株的突變株進行傳代試驗以測定其遺傳穩定性，最終得到固氮促生能力遺傳穩定的 菌株。本發明與化學誘變、紫外輻照誘變、高能粒子束輻照誘變、太空誘變等相比較，突 變株固氮能力增效高、誘變選育成本低、操作簡單安全，育種效率高。目前促生微生物優良 菌種的誘變選育主要采用紫外輻照誘變、化學誘變、高能粒子束及高能電子束輻照的方法， 其誘變原方式各異，但根本的原理都是通過破壞菌體原有DNA結構和堿基序列，并使其產 生重組和修復，在此過程中產生可遺傳的變異。紫外誘變由于穿透性較弱，需要人工對菌液 進行攪拌，使大量菌體接觸到紫外線照射，而化學誘變所使用的藥品對人體有很強的致癌 致病性，因此紫外線輻照誘變和化學誘變對人體可能造成的傷害較大。高能粒子束輻照誘 變則相對安全，但超過一定劑量后，菌液會出現次生放射性。此外，高能粒子束輻照的設備 昂貴，僅能在少數有條件的研發單位完成。微波輻照誘變固氮微生物不存在次生放射性問 題，也沒有化學藥劑的殘留和污染，安全性高。由于微波輻照使用的設備廉價易得，操作簡 便，也提高了菌株選育的效率和降低了選育成本，具有很好的實用性和可靠性。本發明的高效固氮微生物微波誘變育種的主要優點為1、設備廉價、輻照條件可控性和安全性好由于微波輻照處理以民用微波爐為輻照源，設備廉價易得。輻照處理的主要參數 為輻照功率和輻照時間，均可通過調整輻照火力檔位和照射時間來控制，降低了菌株輻照 誘變的操作難度。目前普通微波爐安全性都比較高，不會出現微波泄漏，同時微波輻照的原 理與粒子束輻照不同，不論劑量大小，處理后的菌液都不存在次生放射性的可能，這對操作 人員的安全提供了保障。2、高效突變株選育效率高固氮微生物菌株經過微波輻照誘變后，在最優輻照參數下，克雷伯氏菌(250W， 36s)，苜蓿根瘤菌(800W，12s)、圓褐固氮菌(150W, 178s或100W，240s)、紅豆草根瘤菌 (1050ff,5s)等固氮微生物均可達到14%以上的正突變率。結合無氮培養基上的單菌落直
4徑大小來定性比較突變菌株的固氮能力，以乙炔還原法完成純培養物的固氮酶活性定量測 定，即可在1 2周內完成菌株的誘變和篩選過程，初步得到優良的突變株。3、突變株固氮能力增效高經微波輻照時，具有電磁極性的水分子發生高頻振蕩，固氮微生物的DNA雙鏈結 構受到水分子的劇烈摩擦，產生的增效變異較大。得到的優良突變株菌體純培養物或其共 生固氮體系(根瘤)的固氮能力增效分別達47. 03% 3884. 01% (固氮菌純培養物)和 26. 02% 159. 28% (共生固氮菌的根瘤)，與原始菌株差異均達極顯著水平(P < 0. 01)；4、操作簡便，易于掌握該技術原理簡單易于理解，涉及的固氮微生物優良株篩選方法已比較成熟，便于 操作，能夠適應不同的生產和研發環境。
具體實施例方式以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用 于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。以苜蓿根瘤菌、圓褐固氮菌、克雷伯氏菌、紅豆草根瘤菌等固氮菌種為例來說明本 發明的微波輻照誘變育種方法采用2400 2500MHz、中心波長122mm的微波對固氮微生物的培養菌液(OD6tltlnm =0. 5)進行微波輻照處理(根據固氮菌種的不同，輻照功率為100W至1050W，照射時間 5s至240s不等)，以正突變率最高的輻照功率為固氮菌株的最佳輻照參數。將在最佳輻 照參數下照射后的根瘤菌(800W，12s)、圓褐固氮菌(150W，178s或100W，240s)、克雷伯氏 菌(250W，36s)、紅豆草根瘤菌(1050W，5s)等固氮微生物的菌懸液(菌含量約1 XlO4Cfu. mno. 2ml分別涂布于Winogradsky無氮固體培養基上(培養基母液配制=KH2PO4(50. Og/ L)，MgS047H20 (25. Og/L)，NaCl (25. Og/L)，FeS047H20 (1. Og/L)，Na2Mo042H20 (1. Og/L)， MnS044H20(l. Og/L)，加1000ml蒸餾水溶解后以IM NaOH調節pH為7. 2。5ml培養基母液 用10g/L的甘露醇溶液定容至1000ml，加入CaCO3粉末(0. lg/L)，以2M H2SO4調節pH值 為6. 2。固體培養基經0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后添加瓊脂15g/L，調節pH值為6. 8后高 溫高壓滅菌)，分別培養7d (苜蓿根瘤菌，紅豆草根瘤菌)或5d (圓褐固氮菌，克雷伯氏菌 等兼性厭氧固氮菌)后選擇單菌落生長直徑明顯大于原始菌株的突變株，通過對初選的 突變株進行純培養物或共生根瘤(由根瘤菌突變株誘導植物根系并形成的共生固氮瘤狀 體)固氮酶活性的測定，篩選出固氮酶活性明顯高于原始菌株的高效固氮突變株。將突變 株培養液施入栽培植株(非結瘤固氮菌接種植物為燕麥；苜蓿根瘤菌和紅豆草根瘤菌的接 種植物分別為紫花苜蓿和紅豆草)根部以驗證突變株的促生效果，對固氮酶活性和植物促 生效果均顯著強于出發菌株的突變株進行傳代試驗以測定其遺傳穩定性，最終得到固氮促 生能力遺傳穩定的菌株。以這一輻照誘變方法獲得的菌株固氮酶活性增效達47. 03% 3884.01%。誘導出的高效固氮菌突變株對燕麥干重的增加量達14. 44% 36. 43%，較原 始菌株提高33. 58 % 137. 10 %，對苜蓿干重的增加量達11. 02 58. 54%，較原始菌株 提高14. 98% 90. 50%。對紅豆草干重的增加量達14. 13 35. 96%，較原始菌株提高 21. 22% 111. 76%。統計分析表明，高效突變株的固氮酶活性和對植株干重的增加量與原 始菌株間的差異分別達顯著(P < 0. 05)和極顯著水平(P < 0. 01)。
最后應說明的是以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的 保護范圍之內。
權利要求
一種高效固氮微生物誘變育種方法，包括固氮微生物的誘變處理、篩選及多代定向選擇，其特征在于所述誘變處理是采用2400～2500MHz、中心波長122mm的微波輻照處理固氮微生物培養液，輻照功率為100W～1050W，照射時間為5s～240s。
2.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述微波輻照 的頻率為2450MHz。
3.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述固氮微生 物培養液在600nm時的OD值為0. 5及以上。
4.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述固氮微生 物為苜蓿根瘤菌，微波輻照功率為800W，照射時間為12s。
5.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述固氮微生 物為圓褐固氮菌，微波輻照功率為150W，照射時間為178s，或輻照功率為100W，照射時間為 240s。
6.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述固氮微生 物為克雷伯氏菌，微波輻照功率為250W，照射時間為36s。
7.根據權利要求1所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述固氮微生 物為紅豆草根瘤菌，微波輻照功率為1050W，照射時間為5s。
8.根據權利要求1 7所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述篩選的 步驟為將經微波輻照誘變處理后的固氮微生物的菌懸液涂布于Winogradsky無氮固體培養 基上培養，選擇菌落生長直徑明顯大于原始菌株的突變株，后采用乙炔還原法完成純培養 物的固氮酶活性定量測定，初步得到優良的突變株。
9.根據權利要求8所述的高效固氮微生物誘變育種方法，其特征在于，所述多代定向 選擇的步驟為將經篩選得到的突變株培養液施入栽培植物根部以驗證突變株的促生效果，對固氮酶 活性和植物促生效果均顯著強于出發菌株的突變株進行傳代試驗以測定其遺傳穩定性，最 終得到固氮促生能力遺傳穩定的菌株。
全文摘要
本發明公開了一種高效固氮微生物誘變育種方法，這一方法是采用2400～2500MHz、中心波長122mm的微波對固氮微生物培養液輻照處理一定時間。這一特定波長的微波能對固氮微生物某些特定DNA片段發生誘變作用，引起菌株固氮能力的遺傳變異，用2450MHz的微波輻射誘變處理效果最好。通過以無氮培養基分離和菌株固氮酶活性的測定，對高效固氮突變株進行多代定向選擇，選育出具有固氮能力強于原始株的穩定高效突變株。本發明與紫外線誘變、高能粒子束誘變和化學誘變等誘變方式相比較，具有安全清潔、設備簡單、廉價高效的特點，可以提高高效固氮微生物的育種效率和降低育種成本。
文檔編號C12N15/01GK101899430SQ20101022386
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月12日 優先權日2010年7月12日
發明者師尚禮, 張淑卿, 李劍峰, 霍平慧 申請人:甘肅農業大學