專利名稱：具有△⁶脂肪酸脫氫酶功能的突變基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物編碼突變基因及其應用。具體地，涉及一個具有完整閱讀框架的突變基因mRnD6D，其來源于黑茶薦子(Ribes nigrum L.)的一段DNA序列的突變。本發明還涉及該突變基因所編碼具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能的多肽，以及含有該DNA序列的低等真核細胞表達載體和植物表達載體、宿主細胞以及利用該基因分別轉化低等真核生物和植物生產GLA和OTA的應用。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)是一類重要的生物營養物質，它是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長為18 22個碳原子的直鏈脂肪酸。 PUFA在機體內具有較廣泛的生理功能和生物學效應。其中，亞油酸(linoleic acid, LA, C18:2"9'12)及亞麻酸被公認為人體必需脂肪酸(essential fatty acids, EFA)，可進一步衍生為具有不同功能的高度不飽和脂肪酸，如花生四烯酸(arachidonic Acid,AA,C20:4"5' 8'"'4)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA, C20 5^8'11'14'17)、二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic, DHA, C206Δ4'7'10'13'16'19)等[1](參見后附參考文獻目錄)。Y-亞麻酸(y-Iinolenic acid, GLA, C18 3Δ6'9'12)屬于多不飽和脂肪酸，含有 3 個雙鍵。GLA是生理活性物質ΑΑ、前列腺素、血栓烷素(thromboxanes)和白細胞三烯等的重要前體。同時作為一種人體必需的不飽和脂肪酸，GLA具有降血脂、抗脂質過氧化、減肥、 抑制潰瘍、抗血栓性心血管疾病等一系列生物學功能[2]。目前國際上已將其作為一種新的維生素-維生素F進行研究利用[3]。GLA 存在于部分真菌、小球藻(Chlorella spp.)、螺旋藻(Spirulina spp.) 中。高等植物中只有柳葉菜科的月見草(Oenothera sp.)、紫草科的琉璃苣(Borago officinalis)和虎耳草科的黑茶薦子(黑穗醋栗，Ribes nigrum L.)等少數植物種子中發現含有較高的GUU4]。重要的油料作物油菜、大豆、花生等都不含GLA。目前GLA的主要來源是黑茶薦子油、月見草油和琉璃苣油。人體可少量合成GLA，但仍需要從部分藻類、真菌等天然食品中攝取GLA，也可從保健食品攝取，如以黑茶薦子油、月見草油和琉璃苣油為原料提取GLA，制成的膠囊或食品添加劑或兌制的食用油等。十八碳四烯酸(octadecatetraenoicacids, OTA, C18 4Δ6'9'12'15)是 EPA 和 DHA 的代謝前體，在人體內很容易轉化為EPA和DHA，利用效率是α -亞麻酸(α -linolenic acid, ALA, 018:3Δ9'12'15)的4倍，可以有效緩解與EPA和DHA缺乏有關的生理疾病。當然通過直接補充EPA或DHA也可以獲得同樣效果。近期研究顯示含有OTA的基因工程大豆油，可以作為具有保護心血管作用的ω-3脂肪酸的有效替代品[5]。在脂肪酸代謝過程中，Δ 6-脂肪酸脫氫酶(A6_fatty acid desaturase,D6D)催化LA和ALA的C-6位脫氫分別生成GLA和0ΤΑ。Δ6脂肪酸脫氫酶是GLA和OTA合成中的關鍵酶，近年來已被越來越多的研究和利用。迄今為止，Δ6脂肪酸脫氫酶基因已從動物W]、 植物[7]、真菌[8]和線蟲[9]等不同生物中克隆獲得，并在釀酒酵母[9，10]、番茄[11]、煙草[7，12]、芥菜[8，10]和大豆[13]中成功獲得了表達。在植物中，GLA和OTA僅存在于月見草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Borago officinalis L.)、黑茶薦子等少數幾種植物中[14]，這些植物的種子油也是目前世界上 GLA和OTA的主要商業來源。利用產油真菌發酵也可提取獲得GLA和0ΤΑ。但通過現有的這些生產方式獲得的GLA和OTA產量都很低，遠遠不能滿足日益增長的市場需求[15]。因此，利用釀酒酵母或轉基因油料作物植株表達外源Δ6脂肪酸脫氫酶來生產GLA和OTA具有重要的研究意義和經濟價值。此外，雖然琉璃苣[6]具有Δ 6脂肪酸脫氫酶基因在國外已有研究報道，本研究組也報道了兩個來源于黑茶薦子的Δ6脂肪酸脫氫酶基因[16]，然而本申請的突變基因具有更高的Δ6脂肪酸脫氫酶催化能力，迄今在國內外未見報道。本發明涉及的基因foiD6D和foiD8A系本實驗室從黑茶薦子中克隆得到的兩個高度同源的基因，其編碼框序列相似性達86%，它們同屬于含Cytb5結構域的脂肪酸脫氫酶家族。然而盡管二者同源性很高，但是它們卻在植物中行使不同的功能其中^iDSA是植物 Δ8鞘脂脫氫酶，可以催化高等植物鞘脂長鏈基(long chain base, LCB)的Δ8位脫氫；而 RnD6D是Δ6脂肪酸脫氫酶，以LA和ALA為底物，Δ6位脫氫生成GLA和SDA。Δ8鞘脂脫氫酶普遍存在于各種高等植物中，而Δ6脂肪酸脫氫酶僅存在于如琉璃苣、月見草等少數植物種群中。由于二者具有很高的同源性，但是卻行使不同的催化功能，研究者試圖將二者進行融合突變改造，期待發現一些與二者行使功能相關的重要功能域。

發明內容
本發明提供了一個突變基因mRnD6D，其核苷酸酸序列分別如SEQ ID N0:1所示， 這個基因來源于黑茶薦子(Ribes nigrum L.)的DNA片段的突變，所編碼的多肽如SEQ ID NO 2所示。本發明的另一個目的是提供含基因mRnD6D的低等真核細胞表達載體如酵母表達載體，以及利用該表達載體轉化的酵母細胞。在轉化的酵母細胞中所表達的多肽具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能，可以分別催化外加底物亞油酸和α-亞麻酸分別生成Y-亞麻酸(GLA) 和十八碳四烯酸(OTA)。由于這類基因所編碼的是一個蛋白，可采用釀酒酵母表達體系來進行體外表達， 但由于該蛋白為膜蛋白，在體外表達體系中即使表達出來，亦較難分離純化。故一般采用考察所表達的蛋白對外加底物的催化活性的方法來進行功能鑒定。在所采用的釀酒酵母表達體系中，受體菌是尿嘧啶缺陷型INV Sc I，本身不含 LA (亞油酸)、ALA ( α -亞麻酸)、GLA ( γ -亞麻酸)和0ΤΑ，因此，在添加底物亞油酸的條件下，如若在酵母工程菌中檢測到催化產物GLA或0ΤΑ，就可以確定外源基因所編碼蛋白在釀酒酵母表達體系中獲得了表達，對外加底物產生了催化作用。所以釀酒酵母已經作為研究外源的Δ6、Δ12-脂肪酸脫氫酶基因功能性鑒定的最常用、最有效的表達體系，且已有許多成功的研究報道[7，8，9]。脂肪酸的檢測主要采用GC-MS (氣相色譜-質譜聯用技術)來完成。其原理是通過GC (氣相色譜)將不同的脂肪酸組分分離，然后通過MS (質譜)檢測器分別對每種組分進行質譜定性分析，從而確定每一種組分的成分及含量的比較成熟的聯用分析技術。本發明還涉及突變基因mRnD6D在生產GLA和OTA中的應用。
本發明利用來源于黑茶薦子(Ribes nigrum L. )DNA中的具有完整閱讀框架的基因foiD6D的突變基因mRnD6D，將其在酵母表達體系中進行了表達。通過GC-MS分析表明，在酵母中這個突變基因所編碼的蛋白可以分別催化外加底物亞油酸(LA)和α -亞麻酸(ALA) 分別生成Y-亞麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(0ΤΑ)，具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能，并且催化能力顯著高于toD6D。本發明可應用于采用基因工程技術以低等真核細胞表達體系和植物表達體系生產GLA和OTA。更具體地，本發明提供以下各項1.具有Δ6脂肪酸脫氫酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。2.編碼以上1所述的多肽的核苷酸序列，優選其為如SEQ ID NO :1所示的突變基因 mRnD6D。3. 一種表達載體，其特征在于包含以上2所述的核苷酸序列。4.以上3的表達載體，其為低等真核細胞表達載體或植物表達載體。5.以上4的表達載體，其中低等真核細胞表達載體選自PYES2等用于低等真核細胞表達的載體。6.以上4的表達載體，其中所述植物表達載體選自pBIN19、pBI121、pB221、 pCambia 1300、pGreen等的植物表達載體。這些植物表達載體都是現有技術中公知的和可商購的。7.以上3的表達載體，其特征在于還包含啟動子，所述啟動子選自花椰菜花葉病毒CaMV35S、Ubiqutin, Actin、或植物組織部位特異表達啟動子，所述啟動子單獨使用或組合使用。這些啟動子的結構和性質都是本領域技術人員所公知的。8. 一種宿主細胞，其特征在于包含以上3-7中任一項的表達載體。9.以上8的宿主細胞，其中所述表達載體是通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒表達載體、直接的DNA轉化、微注射或電穿孔的方式導入所述宿主細胞。10.以上8或9的宿主細胞，其為低等真核細胞或植物細胞。11.以上10的宿主細胞，其中所述低等真核細胞為酵母、藻類等的細胞，所述植物細胞包括煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻、花生和芥菜等細胞。12.以上1的多肽、以上2的核苷酸序列、以上3-7中任一項的表達載體、以上8_11 中任一項的宿主細胞在將亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)分別酶促轉化為亞麻酸 (GLA)和十八碳四烯酸(OTA)中的應用。13.功能結構域，其氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。14.編碼以上13的功能結構域的核苷酸序列，優選其為SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列。


圖 1. mRnD6D 片段核苷酸序列，SEQ ID NO :1。圖2.基因mRnD6D所編碼的多肽序列，SEQ ID NO :2。圖3.基因mRnD6D的酵母表達載體圖。圖4.基因foiD6D和mRnD6D在釀酒酵母表達中表達的總脂肪酸GC-MS分析a) INV Sc I酵母菌株脂肪酸組成的GC-MS ；
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b)含空載pYES2表達質粒酵母的總脂肪酸GC-MS ；c)含空載pYES2表達質粒酵母在添加LA和ALA底物誘導后的總脂肪酸GC-MS ；d)表達foiD6D基因的酵母在添加LA和ALA底物誘導后的總脂肪酸GC-MS，左邊 (紅色)箭頭所指為產物峰GLA，右邊(黑色)箭頭指示目的產物OTA ；e)表達mRnD6D基因的酵母在添加LA和ALA底物誘導后的總脂肪酸GC-MS，左邊 (紅色)箭頭所指為產物峰GLA，右邊(黑色)箭頭指示目的產物OTA ；圖5. PCR擴增法突變法的示意圖；圖6. mRnD6D與I nD6D及I nD8A的編碼核苷酸序列比對圖(帶下劃線部分是mRnD6D 基因與I nD6D基因不同的區段如SEQ ID NO 8所示)；和 圖7. mRnD6D與I nD6D及I nD8A的氨基酸序列比對圖(帶下劃線部分是mRnD6D與 RnD6D不同的區段如SEQ ID NO 7所示)；圖8.mRnD6D與I nD6D相區別的功能結構域(如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列)； 和圖9.編碼mRnD6D與I nD6D相區別的功能結構域的核苷酸序列(如SEQ ID NO 8 所示的核苷酸序列)。
具體實施例方式下面參考實施例和附圖詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可以理解的是， 下述實施例是舉例說明的目的，其不應以任何方式解釋為對本發明的限制。本發明的保護范圍由后附的權利要求所限定。實施例一、mRnD6D基因的獲得1.黑茶薦子基因組DNA的制備取黑茶薦子幼嫩葉片約0. 5g，加入液氮快速研磨成粉末，轉入IOmL離心管中，加入2mL預熱的CTAB抽提液，混勻；65°C溫育池，期間緩慢顛倒混勻2 3次；加入等體積酚 /氯仿/異戊醇05 24 1 V/V/V)，緩慢顛倒混勻后抽提一次；加入等體積氯仿/異戊醇 (24 1 V/V)，緩慢顛倒混勻后再抽提一次；室溫，3070 Xg離心lOmin，上清轉入另一 IOmL 離心管；加等體積異丙醇，緩慢顛倒混勻，_20°C放置池；室溫，3070 Xg離心lOmin，取上清； 70%乙醇2mL洗滌沉淀2次，吹干；用100 μ L含RNase Α(終濃度50ng/mL)的無菌dd H20 溶解沉淀；37°C消化30min ；直接使用或_20°C保存。2. RnD6D, RnD8A DNA 片段的克隆foiD6D DNA片段的克隆所用引物RnD6D L 5，CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3’ (SEQ ID NO 3)RnD6D R 5，CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3 ’ (SEQ ID NO 4)foiDSA DNA片段的克隆所用引物RnD8A L :5，-CGCGGGTACCATGGCTGGTGTTGTTGAAAAG-3，(SEQ ID NO 5)RnD8A R :5，-CGCCGAGCTCTCAGCCATGGGTGTTGACAG-3，(SEQID NO 6)PCR 反應體系(50) =DNA 模板1 μ L (50ng)，Pyrobest (Takara) (5U/ μ L) :0. 5 μ L, IOXPCR 緩沖液5 μ L，PL :2. 5 μ L，PR :2. 5 μ L，dNTP(IOmM) :2 μ L，ddH20 :36. 5 μ L。PCR 程序預變性95°C 4min ；變性94°C 30s，退火55°C lmin，延伸72°C 3min,30個循環；延伸720C IOmin。將和foiDSA的PCR產物分別于1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，獲得 RnD6D和foiD8A的PCR片段，平端連入克隆載體pEASY-blunt (Transgene,北京)，獲得質粒 RnD6D-pb和I nD8A-pb，轉化大腸桿菌DH5 α，測序驗證并用作mRnD6D構建的模板。3. mRnD6D 的獲得mRnD6D構建所用弓丨物RnD6D L :5，-CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3，(SEQ ID NO 3)RnD6D R :5，-CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3，(SEQ ID NO 4)RnD8A R :5’ -CGCCGAGCTCTCAGCCATGGGTGTTGACAG-3，(SEQ ID NO 6)DA8R1 :GCTAGCACAAACATCACCCTCTCAGTCCAATTGGDA8L2 :CCAATTGGACTGAGAGGGTGATGTTTGTGCTAGCAD9R1 :CATATAATTATCAGCCGAGAAATGGTTCAAACAD9L2 :GTTTGAACCATTTCTCGGCTGATAATTATATG本文中融合基因和突變基因的克隆采用重疊PCR方法[17]，首先構建中間突變基因 mRnD6D-mid。第一輪PCR反應體系(50 μ L)目的片段1的擴增體系質粒模板foiD6D_pb lyL(50ng) ；pfu 酶(2. 5U/ μ L) :1 μ L ;10XPCR 緩沖液5 μ L ；引物 I nD6D L:lyL;引物 DA8R1 1 μ L ；dNTP (IOmM) :1 μ L ；ddH20 :40 μ L。目的片段2的擴增體系質粒模板RnD8A-pb 1 μ L (50ng) ；pfu酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L ； 10XPCR 緩沖液5μ L ；引物 DA8L2 :1 μ L ；引物 RnD8A R=IyL ；dNTP(IOmM) 1 μ L ； ddH20 :40μ L。PCR 程序預變性 95°C 4min ；變性 94°C 30sec，退火 55°C 40sec，延伸 72°C 2min 30sec，30 個循環；延伸 72°C IOmin0將第一輪兩反應的PCR產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，分別獲得目的片段 1、2。第二輪PCR反應體系(50 μ L)將1、2等量混合(約各取IOOng) ；pfu酶O. 5U/ μ L) L :1 μ L ；引物 RnD8A R=IyL ；dNTP(IOmM) 1 μ L ；ddH20補充至50 μ L體系。PCR程序同第一輪。第二輪PCR產物于1. 0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，獲得mRnD6D-mid融合基因， 平端連入克隆載體pEASY-blunt，獲得質粒mRnD6D-mid-pb，轉化大腸桿菌DH5 α，測序驗證并用作mRnD6D構建的模板。mRnD6D的獲得第一輪PCR反應體系(50 μ L):目的片段3的擴增體系質粒模板 mRnD6D-mid-pb 1 μ L(50ng) ；pfu 酶(2. 5U/μ L) :1 μ L ;10XPCR 緩沖液5 μ L ；引物 I nD6D L 1 μ L ；引物 AD9R1 :1 μ L ；dNTP (IOmM) :1 μ L ；ddH20 :40 μ L。目的片段4 的擴增體系質粒模板 RnD6D 1 μ L (50ng) ；pfu g| (2. 5U/ μ L) : 1 μ L ； 10XPCR 緩沖液5μ L ；引物 AD9L2 :1 μ L ；引物 RnD6D R=IyL ； dNTP (IOmM) :1 μ L ； ddH20 40 μ L0PCR 程序預變性 95°C 4min ；變性 94°C 30sec，退火 55°C 40sec,延伸 72°C 2min 30sec，30 個循環；延伸 72°C IOmin0
將第一輪兩反應的PCR產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，分別獲得目的片段 3、4。第二輪PCR反應體系(50 μ L)將3、4等量混合(約各取IOOng) ；pfu酶(2. 5U/ μ L) L :1 μ L ；引物 RnD6D R 1 μ L ;dNTP(IOmM) 1 μ L ；ddH20補充至50 μ L體系。PCR程序同第一輪。第二輪PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，獲得mRnD6D融合基因，平端連入克隆載體pEASY-blimt，轉化大腸桿菌DH5 α，測序驗證并保存。為了清楚起見，在附圖中提供了上述PCR擴增法突變的示意圖(圖5)，mRnD6D與 RnD6D及foiDSA編碼核苷酸/氨基酸序列比對見附圖6，7。實施例二、mRnD6D基因酵母載體的構建經PCR產物mRnD6D利用引物上帶有的Kpn I, Sac I酶切位點，雙切后獲得 mRnD6D基因，定向克隆于酵母表達載體pYES2(購自Ivitrogen公司)，獲得酵母表達質粒 PYmRnD6D，轉化大腸桿菌DH-5 α (購自Ivitrogen公司)保存。其載體圖見圖3。實施例三、mRnD6D基因在酵母中的表達1.酵母的轉化參照hvitrogen公司pYES2 Kit(Cat# V285-20)所述方法，將上述嵌合基因的酵母表達質粒PYmRnD6D，采用醋酸鋰介導轉化釀酒酵母營養缺陷型菌株INV Sc I (購于 Invitrogen公司)，以空載pYES2質粒為對照，獲得含有各表達質粒的酵母細胞。2.轉化酵母細胞的誘導表達取含目的基因的酵母表達質粒轉化的酵母單菌落，接種于50ml SC_U培養液(參照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)含2% (wt/v)棉籽糖的SC-U培養液中，250rpm， 28°C，培養過夜；加入Tergitol NP-40 (Fluka)(終濃度1 % (ν/ν))、外源亞油酸和α-亞麻酸底物(Sigma)(終濃度為0. 003% (wt/v)),以及酵母表達誘導物D-半乳糖(Amresco) (終濃度為2% (wt/V))250rpm，22°C培養7 誘導表達。實施例四、mRnD6D基因酵母表達物對Δ6脂肪酸脫氫酶底物催化產物的GC-MS分析脂肪酸的提取與甲酯化。離心收集取誘導后的酵母菌體，去離子水洗滌，50°C烘干。取40mg酵母粉(在實例3. 2中所誘導獲得的酵母經50°C烘干即得)充分研磨，加入:3ml 7. 5% KOH-CH3OH, 70°C水浴3h后加入HCl酸化至其pH值達2.0。再加入anl 14% BF3-CH3OH (購自Aldtich公司) 溶液，70°C水浴1.釙。加入Iml 0.9% NaCl溶液，混勻后靜止片刻。加入2ml正己烷抽提兩次，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100 μ 1乙酸乙酯。終產物GC-MS檢測分析實驗。所用GC-/MS 儀為 TurboMass (PerkinElmer 公司)，柱子ΒΡΧ-90， 30mX0. 25mmX0. 25vm，柱溫120°C，氣化室溫度230°C。取1 μ 1終產物上樣，分流比10 1。GC-MS結果分析。對比圖4(a)、4(b)，表明在不添加亞油酸(LA)、α -亞麻酸(ALA)底物條件下，所用酵母工程植株以及含經誘導的空載PYES2表達質粒酵母中沒有新的產物峰出現，說明所用酵母工程菌株及空載PYES2表達質粒酵母的總脂肪酸中不含外加底物LA和ALA及催化產物Y -亞麻酸(GLA)、十八碳四烯酸(OTA)。當添加LA和ALA底物，并進行誘導表達時，對照(空載pYES2)亦沒有產物峰GLA 和OTA的出現(參見圖4 (c))。而含RnD6D和mRnD6D的酵母表達菌被誘導后，外加底物LA 和ALA可以被催化生成GLA和OTA(參見圖4(d)和圖4(e))；且mRnD6D的催化能力大大高于RnD6D，mRnD6D對LA的轉化能力約為RnD6D的2. 5倍，對ALA的轉化能力約為RnD6D的 2倍(三次實驗的平均值，見表1)。表1轉基因酵母對底物LA和ALA轉化效率的比較(數值代表轉化效率即產物量/底物量)
權利要求
1.具有Δ6脂肪酸脫氫酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQID Ν0:2所示。
2.編碼權利要求1所述的多肽的核苷酸序列，優選其為如SEQID NO :1所示的突變基因 mRnD6D。
3.—種表達載體，其特征在于包含權利要求2所述的核苷酸序列，優選其為低等真核細胞表達載體或植物表達載體，更優選其中低等真核細胞表達載體選自PYES2等用于低等真核細胞表達的載體。
4.權利要求3的表達載體，其中所述植物表達載體選自pBIN19、pBI121、pB221、 pCambia 1300、pGreen等的植物表達載體。
5.權利要求3的表達載體，其特征在于還包含啟動子，所述啟動子選自花椰菜花葉病毒CaMV35S、Ubiqutin, Actin、或植物組織部位特異表達啟動子，所述啟動子單獨使用或組合使用。
6.一種宿主細胞，其特征在于包含權利要求3-5中任一項的表達載體，優選其中所述表達載體是通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒表達載體、直接的DNA轉化、微注射或電穿孔的方式導入所述宿主細胞。
7.權利要求6的宿主細胞，其為低等真核細胞或植物細胞，優選其中所述低等真核細胞為酵母、藻類等的細胞，所述植物細胞包括煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻、花生和芥菜等細胞。
8.權利要求1的多肽、權利要求2的核苷酸序列、權利要求3-5中任一項的表達載體、 權利要求6-7中任一項的宿主細胞在將亞油酸(LA)和α -亞麻酸(ALA)分別轉化為γ-亞麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA)中的應用。
9.功能結構域，其氨基酸序列如SEQID Ν0:7所示。
10.編碼權利要求9的功能結構域的核苷酸序列，優選其為SEQID NO :8所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能的突變基因及其應用。本發明創制了在來源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)DNA中的具有完整閱讀框架的基因RnD6D的基礎上，創制了突變基因mRnD6D，將其在酵母表達體系中進行了表達。通過GC-MS分析表明，在酵母中這個突變基因所編碼的蛋白可以分別催化外加底物亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)分別生成γ一亞麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA)，具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能，并且催化能力顯著高于RnD6D。本發明可應用于采用基因工程技術以低等真核細胞表達體系和植物表達體系生產GLA和OTA。
文檔編號C12N9/02GK102399758SQ20101028751
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月17日 優先權日2010年9月17日
發明者宋麗英, 尹維波, 胡贊民, 陳宇紅 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所