專利名稱：VEGF-165及HβD3雙基因質粒載體及其構建方法
技術領域：
本發明屬于生物基因治療領域，具體地說，涉及可在基因重組技術中使用的質粒 載體及其構建方法；更具體地說，是涉及具有VEGF-165和Ηβ D3雙基因真核表達重組質粒 載體及其構建方法。
背景技術：
隨著社會經濟的發展和工業化程度的日益提高，創傷與其他意外傷害所致的死亡 在我國已成為僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病、呼吸系統疾病的第四大死亡原因，在青壯年 中則占第一位。因此，深入開展創傷與創傷后組織修復的研究不僅是創傷醫學深入發展的 需要，也是現代社會發展的重要需求。目前，對于頌面部及人體其它部位創傷的修復，特別 是大型組織缺失的創傷修復多采用“以創傷修復創傷”的治療模式，雖然對局部創傷組織缺 失的修復起到明顯的療效，挽救了患者生命，創傷后一次性組織瓣移植修復創傷缺損也大 大縮短了患者的治療時間，但是由于組織瓣的來源是患者身體其它部位的正常機體，術后 必定為供區帶來新的創傷，留下新的瘢痕，甚至功能障礙，對患者術后的生活質量帶來一定 的影響。如何以“無創修復創傷”的方式治療這一疾病，是目前急待解決的課題。機體損傷后出現協調的愈合過程，其中包括多種細胞、細胞因子和細胞外基質之 間錯綜復雜的網絡作用。細胞因子在創傷愈合過程中具有重要作用，它能調節創傷修復過 程中的多種細胞反應，影響細胞增殖、遷移、細胞外基質合成和釋放等。在眾多細胞因子中， 血管內皮生長因子(VEGF)是一重要的促愈合因子，免疫組化顯示VEGF的表達主要位于上 皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的胞漿中，無論是在傷前組織還是傷后不同修復階段的組 織中，VEGF均呈持續性陽性表達，提示VEGF在頌面部組織中具有較為豐富的來源，顯示了 其所能發揮的作用。因此，我們特異性選擇VEGF作為促進創面愈合的活性多肽，是較為理 想而可行的。對于創口中的感染采用抗菌素治療是常用的方法，確能有效抑制或殺滅敏感細 菌，但抗菌素不能中和毒素、不能抵抗真菌，此外，尤其是廣譜抗菌素還可加重機體內F常 生態菌群失調節器，更進一步削弱了機體內環境微生態屏障，形成新的感染誘發因素。研究 發現防御素(defensin)有明顯的殺菌和抑菌作用，并有抗真菌和中和毒素的作用，其效果 與防御素量呈正相關，防御素在機體內抗感染方面具有獨特的優點。防御素是機體抵御病 原微生物入侵的天然免疫的重要介質，人類β防御素(1 3)廣泛表達于口腔組織，如口 腔粘膜、唾液腺、牙齦、舌等組織，在口腔上皮天然宿主防御反應中發揮重要作用。其中β 防御素_3相對于其它防御素對鹽濃度不敏感，對多藥抗藥性的金色葡萄球菌和抗萬古霉 素的糞腸球菌具有強大的殺菌作用，對革蘭氏陽性菌殺傷力更強，并且不影響口腔內環境 微生態菌群，不傷害人體組織細胞，是理想的抗口腔內感染的活性抗菌肽。綜上，本發明 針對人體軟組織創傷臨床發生率高，危害重，治療難的科學問題，擬 優選VEGF-165和防御素-3為實現既促進創面上皮修復，又能增強機體免疫的協同治療策 略解決問題，為有效治療機體軟組織創傷提供新途徑。

發明內容
本發明的目的之一是構建一種人VEGF-165和人防御素3雙基因重組質粒載體， 為基因治療機體軟組織創傷提供新的途徑。本發明的目的之二 是提供上述重組質粒載體的構建方法。本發明的目的之一，主要通過以下技術方案實現VEGF-165和Hi3D3雙基因質粒載體，其特征是所述的重組質粒載體包括人 VEGF-165 和人 H β D3 基因。

其中，VEGF-165基因序列如序列表1所述。Ηβ D3基因序列如序列表2所述。 pVIVOl-mcs質粒載體的結構圖如表3所示，Ηβ D3基因插入到載體MCSl位點即968_974bp 區域，VEGF-165基因插入到載體MCS2位點即4085_4098bp區域。利用pVIVOl-mcs質粒載 體系統，構建成重組質粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3。本發明所用質粒載體pVIV01-mCS，是雙基因共表達真核載體，宿主范圍廣，轉染效 率和基因表達水平高，暫時性表達，安全性較好，是基因治療的優良載體，應用于創傷愈合 和組織工程等較為理想。本發明的目的之二，主要通過以下技術方案實現一種VEGF-165和Ηβ D3雙基因質粒載體的構建方法，主要包括以下幾個步驟1)獲得人VEGF-165和人Ηβ D3基因；2)用NcoI和EcoRI對H β D3DNA和質粒pVIVOl-mcs進行雙酶切，采用粘端連接法 進行連接，獲得重組質粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3 ；3)再用 BspHI 和 HindIII 對重組質粒 pVIVOl-mcs-Hβ D3 和 VEGF DNA 進行雙酶 切，采用粘端連接法進行連接，得到重組質粒pVIV01-mcs-VEGF165-Hi3 D3 ；4)脂質體介導重組質粒轉染293FT細胞，外源基因在細胞中表達。本發明具有如下技術效果1、本發明選擇特異性促進上皮細胞增殖的血管內皮生長因子(VEGF)和能抗細 菌、抗真菌并能中和毒素的人類βΗβ 3(Ηβ 3)作為活性生物分子，將其克隆到多基因表 達載體pVIVOl-mcs中，并將其轉染損傷粘膜區，使損傷局部表達分泌VEGF和H β D3，同時發 揮這兩種基因的作用，促進創面愈合。動物實驗充分證實VEGF和Hi3D3雙基因療法能夠 加快口腔粘膜組織難愈性創傷的愈合。2、本發明在同一載體上搭載血管內皮生長因子(VEGF)和人類βΗβ 3(Ηβ 3)， 使基因轉染后，兩個外源基因共表達，協同發揮作用。同時多基因表達載體pVIVOl-mcs是 瞬時轉染的，治療后不會對機體產生長久的作用，從而避免了其它并發癥的產生。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明圖1是VEGF-165及Ηβ D3雙基因質粒載體的結構示意圖；圖2獲取的目的基因電泳圖HL-I和HL-2均為從白血病細胞(HL60)中擴增出 hVEGF165cDNA基因片段，YY為從牙齦組織中擴增出Ηβ D3cDNA基因片段；圖3重組質粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3NcoI和EcoRI雙酶切鑒定圖 4 重組質粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 雙酶切鑒定電泳圖 DL2000 和 DL15000 為Marker，P為空載體，VDP165為重組質粒，VDP165-D為重組質粒經Ncol、EcoRI雙酶 切得到的Hi3D3cDNA基因片段，VDP165-V為重組質粒經AgeI、HindIII雙酶切后得到 hVEGF165cDNA 基因片段；圖5轉染了重組質粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3的293FT細胞48h時明場下做 免疫熒光；圖 6 轉染了重組質粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h DAPI 下做免 疫熒光；圖 7 轉染了重組質粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h 綠光下 Ηβ D3 紅色熒光抗體；圖 8 轉染了重組質粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h 藍光下 VEGF 綠色熒光抗體。
具體實施方式
1. 1材料手術中切除的患者牙齦組織由西南醫院口腔科提供，白血病細胞HL-60 由本所曲小龍碩士惠贈，293FT細胞由本所保存，VEGF165和Ηβ D3上下游引物均由上海捷 瑞生物公司合成，其他主要試劑見下表
Γμμ
質粒 pVIVOl-mcsInvivoGen
總RNA提取試劑盒大連寶生物
質粒小提試劑盒北京天根
NcoI酶東洋坊
EcoRI酶東洋坊
HindIII 酶NEB
BspHI IlNEB
AgeI 酶NEB
逆轉錄試劑盒(ReverTra Ace- α )東洋紡
高保真聚合酶(kod-pius)mm
普通DNA產物純化試劑盒北京天根
權利要求
1.VEGF-165及Hi3D3雙基因質粒載體，其特征在于所述重組質粒載體包括人 VEGF-165cDNA，和人 H0D3cDNA，其中 VEGF_165cDNA 基因序列為CCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCGCCTTGCAACGCGAGTCTGT GTTTTTGCAGGAACATTTACACGTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGCTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGCCCACAGG GATTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATG TGCTGGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCC CTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGT ACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACT TCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAA GGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCAT ；H3D3cDNA基因序列為ATGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTGTTTTTGGTGCCTGTTCCAGGTCATGGAGGAATC ATAAACACATTACAGAAATATTATTGCAGAGTCAGAGGCGGCCGGTGTGCTGTGCTCAGCTGCCTTCCAAAGGAGGA ACAGATCGGCAAGTGCTCGACGCGTGGCCGAAAATGCTGCCGAAGAAAGAAATAA。
2.如權利要求1所述的VEGF-165及Hi3D3雙基因質粒載體，其特征在于利用 pVIVOl-mcs質粒載體系統，構建成重組質粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3。
3.VEGF-165及Hi3D3雙基因質粒載體的構建方法，其特征在于包括以下幾個步驟1)獲得人VEGF-165和人Hβ D3基因；2)用NcoI和EcoRI對Hβ D3DNA和質粒pVIVOl-mcs進行雙酶切，采用粘端連接法進行 連接，獲得重組質粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3 ；3)再用BspHI和HindIII對重組質粒pVIVOl-mcs-HβD3和VEGF DNA進行雙酶切，采 用粘端連接法進行連接，得到重組質粒pVIV01-mcs-VEGF165-Hi3 D3 ；4)脂質體介導重組質粒轉染293FT細胞，外源基因在細胞中表達。
4.如權利要求3所述的VEGF-165及Hβ D3雙基因質粒載體的構建方法，其特征在于 通過RT-PCR獲得人VEGF-165和人H β D3基因。
5.如權利要求4所述的VEGF-165及Hβ D3雙基因質粒載體的構建方法，其特征在于 根據Genebank中基因序列設計合成擴增VEGF-165和Ηβ D3的PCR引物其中擴增VEGF-165的PCR引物序列是正向 5，-CCCAAGCTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3 ‘，引入 Hindi 11 位點，反向 5，-CGTCATGACCATGAACTTTCTGCTGT-3'，引入 BspHI 位點，其中擴增 H β D3 的 PCR 引物序列是正向 5 ‘ -CATGCCATGGCAGCTATGAGGATCCAT-3 ‘，引入 Nco I 位點，反向 5 ‘ -CCGGAATTCTCAGGGTTTTTATTTCT-3 ‘，引入 EcoRI 位點。
全文摘要
本發明涉及一種VEGF-165及HβD3雙基因質粒載體及其構建方法，利用pVIVO1-mcs質粒載體系統，采用酶切重組的方式，將人牙齦組織中獲得HβD3cDNA和白血病細胞(HL-60)中獲得VEGF165cDNA構建成重組質粒pVIVO1-mcs-VEGF165-HβD3。本發明將特異性促進上皮細胞增殖的VEGF和能抗細菌、抗真菌并能中和毒素的HβD3重組在同一載體上共同表達，將其應用于創傷愈合，既能促進創面上皮修復，又能增強創傷內環境免疫，達到“雙管齊下”。本發明將在創傷愈合的基因治療和組織工程研究領域發揮重要作用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102031268SQ201010289310
公開日2011年4月27日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者夏章權, 張從紀 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院