專利名稱：一種能夠富集并擴增懸浮血液腫瘤干細胞的新方法、新培養基及其在藥物篩選中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域中的細胞培養基制造，更具體地，涉及一種從血液系統的腫瘤細胞中篩選、培養和擴增相應腫瘤干細胞亞群的技術和方法，作為白血病治療藥物篩選和生物治療、基因治療的篩選、體外評價模型方法和實驗材料。
背景技術：
腫瘤是威脅人類健康的一種重要疾病，是目前人類疾病死亡的第二殺手。白血病是人體循環系統的腫瘤，近年來該疾病的發生呈顯著的增長態勢，并呈現低齡化的趨勢。人們對白血病的治療，主要通過化療的方法。雖然骨髓抑制被認為是治療白血病和淋巴瘤的有效手段，但是由于血液配型等異體抑制排斥作用的存在，嚴重限制了骨髓移植技術的廣泛應用。化療技術雖然能夠顯著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，能夠徹底治愈的仍不普遍。大約50年前，人們最早從髓性白血病的發生和演變規律中提出了腫瘤干細胞的概念S并認為這些腫瘤干細胞是正常干細胞和/或祖細胞通過突變形成的。正常造血干細胞能夠持續分化成造血細胞，如紅細胞、血小板、白細胞(包括T-淋巴細胞和B-淋巴細胞)、中性粒性細胞等。腫瘤干細胞與正常干細胞具有相似的性質，也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血細胞系或未成熟的祖細胞，又稱胚細胞。人們發現并驗證腫瘤干細胞在腫瘤的發生、發展與惡化過程中的作用首先是從急性髓性白血病病人樣品中分離出一種具有表面抗原CD96陽性的腫瘤細胞亞型2，這種腫瘤干細胞在腫瘤中的數目極少，但腫瘤的惡性很強，是腫瘤的化療耐藥的重要原因之一，也是白血病化療失敗的重要根源。因此，尋找新的、高效低毒、對腫瘤干細胞專一的新的腫瘤治療方法和新的藥物篩選模型是徹底治愈腫瘤疾患的一個主要技術瓶徑。目前從臨床血液樣品，骨髓或白血病細胞系分離懸浮腫瘤干細胞仍然是一件非常困難的事，主要原因是由于血液腫瘤干細胞的數目非常少。已經被廣泛采用的分離方法有兩種3，(1)通過標記腫瘤干細胞的特征表面抗原，采用流式細胞分選技術或免疫磁珠分選出富含腫瘤干細胞的組分。目前所使用的表面特征抗原主要有⑶9，⑶33，⑶44，⑶90，⑶96， CD110，CD123等。由于采用單一表面抗原對腫瘤干細胞的區分能力具有局限性，用該法分選出的腫瘤干細胞數量少，分離過程中細胞受損傷以及干細胞的純度不夠高，是限制深入研究腫瘤干細胞的一個技術屏障。( 研究腫瘤干細胞的另一種分選策略是通過細胞流式分選技術將血液腫瘤中的能排出熒光染料，如熒光染料Hoechst 33342，的細胞，稱為側群細胞。由于側群細胞只是相對富集了腫瘤干細胞，通過研究腫瘤側群細胞的性質并不能全面反映腫瘤干細胞的性質。因此目前研究和產品研發上迫切需要由血液腫瘤細胞株直接進行腫瘤干細胞篩選、培養、擴增的簡便方法。

發明內容
本發明主要涉及到一種從血液系統腫瘤細胞中分選、富集、培養和擴增血液腫瘤干細胞的新方法。用該方法獲得的血液腫瘤干細胞具有腫瘤干細胞的特征基因、干細胞表面標志抗原的高表達。用該方法獲得的血液腫瘤干細胞是篩選新型白血病治療藥物的體外模型。本發明的核心內容有以下四個方面。第一方面，本發明提供了一種能快速培養血液腫瘤集落的新的方法。在血液腫瘤細胞的集落培養中，以胚胎干細胞培養基如HE&GR0 中加入jadl等因子為培養基主要組分進行半固體培養，血液腫瘤細胞可以形成集落。該集落具有血液腫瘤干(祖)的特征。本領域的技術人員應該理解，本發明所述的胚胎干細胞培養基是血液腫瘤干細胞集落培養的主要成分，該胚胎干細胞培養基不局限于HE&GR0 ，利用胚胎干細胞培養基為基礎，添加某些細胞增殖相關的成分，如細胞因子。第二方面，本發明提供了能有效富集血液腫瘤干細胞的添加劑。該添加劑，通過抑制GSK信號通路和酪氨酸激酶抑制劑達到有效抑制干細胞分化，提高血液腫瘤干細胞篩選的效率。第三方面，本發明提供了本發明所述的培養基的用途，其可以用于制備血液腫瘤細胞的干細胞。這些腫瘤細胞可以是已經建株的血液腫瘤細胞株，也可以是原代腫瘤細胞。第四方面，本發明提供了包含本發明所述的核心培養基的血液腫瘤干細胞培養試劑盒。第五方面，本發明提供了一種用于篩選對血液腫瘤干細胞專一、高效的新的藥物篩選模型。這里新的藥物不僅是化療藥物(化學合成藥和天然藥物)，也包括現代生物技術藥物，如蛋白、多肽藥物和核酸藥物，小核酸藥物。以下將通過實施例對本發明作進一步的闡述，但實施例并不限制本發明的保護范圍。本領域的技術人員完全可以根據本發明的構思和所公開的技術方案，進行不背離本發明的精神和范圍的修改和變動，這也在本發明的保護范圍之內。


圖1.人急性T-淋巴母細胞瘤Hut-102在含有本發明闡述的半固體瓊脂培養基中接種培養過夜后形成Hut-102干/祖細胞(Hut-102Q集落的照片。細胞的放大倍數為100倍。圖2.人急性T-淋巴母細胞瘤Hut-102和其干/祖細胞Hut_102S懸浮培養傳代的細胞形態。其中Hut-102的培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基，Hut_102S為本發明公開的干細胞培養基。細胞的放大倍數為100倍。圖3.人早幼粒白血病K562細胞在半固體干細胞培養基中的克隆生長。細胞的放大倍數為100倍。圖4.人急性T-淋巴母細胞瘤Hut-102和其干/祖細胞Hut_102S的相關干細胞基因的表達。取人β-actin基因為內參基因。圖5.人急性T-淋巴母細胞瘤Hut-102和其干/祖細胞Hut_102S的相關干細胞抗原的表達。圖6.人早幼粒白血病K562細胞的干細胞的特異表面抗原的表達。圖7.阿霉素和長春新堿分別Hut-102和Hut_102S細胞增殖抑制的量效曲線。其中圖A為阿霉素對細胞增殖的抑制作用曲線，圖B為長春新堿對細胞增殖的抑制作用曲線。 Hut-102和Hut-102S的培養條件與圖2相同，Hut-102和Hut_102S細胞分別在96孔板中接種5000個/孔，過夜后分別加入不同濃度的阿霉素和長春新堿，繼續培養4 后，用活細胞記數試劑盒測量活細胞的相對數目，并以不加化療藥的實驗孔為0抑制率。
具體實施例方式以下將通過實施例對本發明作進一步詳細的闡述。但是，本領域的普通技術人員應該理解，下述實施例僅是用于舉例說明的目的，并不限制本發明的保護范圍，本發明的精神和范圍由后附的權利要求所限定。本領域有關的技術人員完全可以根據本發明的構思和所公開的技術方案，進行不背離本發明的精神和范圍的修改和變動，這也在本發明的保護范圍之內。實施例1. T-淋巴瘤的腫瘤干/祖細胞集落培養、擴增人T-淋巴細胞瘤株Hut-102購自美國細胞庫ATCC(TIB-162)，細胞培養使用含 10%胎牛血清(PAA，FCS500)的DMEM培養基(北京鈕因華信科技有限公司，DM10140021)， 在Coring公司生產的T-25細胞培養瓶中培養，培養條件為37°C，5% CO20細胞每兩天傳代一次。血液腫瘤細胞的集落培養在Corning公司的35mm培養皿中進行。培養皿的下層鋪一層含瓊脂糖的DMEM半固體培養基。另取新的血液腫瘤干細胞培養基(配方見表1)配成0. 3%的瓊脂糖培養基1毫升，并在其中接種1000個Hut-102細胞，混勻后輕輕鋪在1 % 瓊脂糖的上面。本發明公開的懸浮腫瘤干細胞培養基的配方見表1。細胞在37°C，5% CO2 細胞培養箱中培養。第五日在顯微鏡下觀察，可以看到有細胞集落的形成(見圖1)。該方法較目前廣泛使用的造血干細胞集落培養方法更有效更快速。目前通常使用的方法培養血液細胞祖細胞通常需要2周以上。表1 懸浮腫瘤干細胞篩選、擴增用培養基配方
成分含量DMEM基礎培養基0-30% (ν/ν)胚胎干細胞培養基HEScGRO70-100% (ν/ν)DII40-2mg/mlFGF20-lmg/mlJagl0-2mg/mlCHIR990210-300nM
PD173074,0-1 μ MPD1843520-1 μ MPD03259010-1 μ M將Hut-102單集落挑出到細胞培養瓶中，在血液腫瘤干細胞培養基中(37°C，5% CO2)懸浮培養。腫瘤干細胞可以大量擴增。圖2顯示與野生型Hut-102相比，干細胞形狀規則，呈圓形，細胞比野生型稍大。實施例2.早幼粒白血病K562細胞株的細胞干/祖細胞集落培養、擴增人早幼粒白血病K562細胞株購自美國細胞庫ATCC( ？)，細胞培養使用含10% 胎牛血清(PAA，FCS500)的DMEM培養基(北京鈕因華信科技有限公司，DM10140021)，在 Coring公司生產的T-25細胞培養瓶中培養，培養條件為37°C，5% C02。細胞每3天傳代一次。血液腫瘤細胞的集落培養在Corning公司的35mm培養皿中進行。培養皿的下層鋪一層含瓊脂糖的DMEM半固體培養基。另取新的血液腫瘤干細胞培養基(配方見表1)配成0. 3%的瓊脂糖培養基1毫升，并在其中接種1000個K562細胞，混勻后輕輕鋪在瓊脂糖的上面。細胞在37°C，5% CO2細胞培養箱中培養。第五日在顯微鏡下觀察，可以看到有細胞集落的形成(見圖3)。將上述克隆挑出，轉移到本發明公開的干細胞培養基中擴增培養，獲得具有干細胞特性的早幼粒白血病細胞亞群。本發明為研究K562干細胞的行為特征提供了研究素材的保證，因為用傳統的分離方法很難獲得大量的K562干細胞。實施例3.淋巴瘤干細胞的干細胞基因表達為了驗證所篩選、培養的Hut-102新亞型(Hut_102Q是腫瘤干細胞，對該細胞亞型的幾個干細胞特征基因表達情況的變化進行了測定。這里選的是研究胚胎干細胞中使用比較普遍的Nanog，0ct4和Sox2這四個基因。所用的PCR引物見表2，PCR實驗采用天根生物技術公司的RT-PCR試劑盒(KR114)，并按照試劑盒操作說明書進行。圖4給出了在 Hut-102和Hut-102S的PCR產物的凝膠照片。圖中顯示內參基因β -actin在Hut-102和 Hut-102S中的表達量相同，干細胞標志基因NANOG在Hut-102中不表達，在Hut_102S中表達顯著上升，而S0X2基因在Hut-102S的表達出現一定程度的下降，而干細胞基因0ct4在 Hut-102與Hut-102S中的表達沒有顯著的變化。近來有文獻報道4⑶90和⑶110是一個鑒定急性淋巴母細胞瘤干細胞的特征標志物，但是使用本發明制備的腫瘤干細胞Hut-102S 的⑶90和⑶110的表達與野生型細胞沒有差別，兩者的⑶90表達均成陽性，而⑶110的表達均成陰性(結果未顯示)。上述結果驗證了使用本發明的制備方法和培養基獲得的血液腫瘤細胞亞型具有更強的干細胞的基因表達特征，符合血液腫瘤干細胞的特征，且不同于已經鑒定的T-淋巴瘤干細胞。表2PCR用的引物序列
權利要求
1.一種能夠大量并快速富集和培養懸浮腫瘤干細胞的方法及培養基配方。
2.權利1要求所述的快速富集和培養懸浮腫瘤干細胞的方法由下述幾個關鍵環節組成A)制備相互分離的腫瘤細胞懸液，B)無血清的懸浮腫瘤干細胞半固體培養基的配制， C)抑制干細胞分化成份的添加，D)加快干細胞增殖成份的補給，E)腫瘤干細胞與半固體培養基的混合、培養和換液。
3.權利1和2要求所述的培養懸浮腫瘤干細胞的方法及培養基配方，必須在胚胎干細胞培養基或具有類似功能的胚胎干細胞培養基中添加適量的Delta-like4(D114)，Jagged 1 (Jagl)和 FGF2 成分。
4.權利1和2要求所述的培養懸浮腫瘤干細胞的方法及培養基配方，必須在培養基中加入抑制GSK信號通路抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑，這些抑制劑包括但不局限于 CHIR99021, PD173074, PD184352, PD0325901 等。
5.權利1中所要求的培養基配方可包含添加的基礎培養基，如DMEM，RPMI1640；添加的濃度范圍為0-30% (體積/體積)。
6.權利1要求所述的懸浮腫瘤干細胞培養基配方可制造成不同的培養試劑盒，其中包括不同懸浮腫瘤干細胞增殖所需要的細胞增殖因子、細胞分化抑制劑。
7.權利1要求的通過使用本發明的方法和/或培養基獲得的血液腫瘤干細胞標志物， 可用于腫瘤的診斷和治療效果的評估。
8.權利1要求的通過使用本發明的方法和/或培養基獲得的血液腫瘤干細胞可用于化療藥物的篩選、評估和使用。
全文摘要
本發明提供了一種利用胚胎干細胞培養基能夠大量并快速富集和培養血液懸浮腫瘤細胞中的干/祖細胞亞群的新方法和培養基組成。采用胚胎干細胞培養基并通過添加抑制GSK信號通路和酪氨酸激酶的抑制劑小分子化合物以及其它因子，可以在半固體培養基中挑選出血液腫瘤細胞的干/祖細胞克隆，該克隆在本發明所提供的血液腫瘤干細胞培養基中能夠大量懸浮培養和擴增。利用該方法獲得的血液腫瘤干細胞在細胞形態，干細胞基因表達，干細胞表面特征抗原表達等方面均擁有特定的標志，所篩選出的懸浮干細胞的干細胞特性更接近于胚胎干細胞，對化療藥物更具有非常明顯的抗藥性。此項發明在富集和克隆血液懸浮腫瘤干細胞，和篩選和鑒定針對腫瘤干細胞的特效藥物等方面具有很好的應用前景。
文檔編號C12N5/095GK102409026SQ20101028930
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月25日 優先權日2010年9月25日
發明者張洪杰, 殷勤偉, 王珊珊, 黃兵 申請人:張洪杰, 殷勤偉, 黃兵