專利名稱：一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法
技術領域：
:本發明涉及一種小鼠毛囊干細胞向原始生殖細胞分化的技術方法，特別是涉及一種將小鼠毛囊干細胞采用體外培養方式，經過形成擬胚體(EB)進行誘導，然后以小鼠成纖維細胞為飼養層采用共培養方式誘導形成原始生殖細胞的方法。屬于生殖醫學的生物醫學技術領域。
背景技術：
:從2003年開始，多個實驗組報導了他們將哺乳類干細胞，包括人類干細胞，誘導為各發育階段的生殖細胞。在以雄性配子為目標的報導中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因為PGC報告系統(reporter system)及BMP4為誘導因子，將小鼠干細胞誘導為PGCs(原始生殖細胞primordial germ cells);并接著將分離出來的PGCs與睪丸細胞混合后移植到睪丸中產生精子。2004年，Geijsen等利用SSEAl為早期生殖細胞表面標記，加上RA(retinoic acids)誘導小鼠干細胞,成功在體外獲得單倍體,並將其注射入小鼠卵子中，受精卵發育至囊胚期。德國研究小組Nayernia等同樣利用RA誘導小鼠干細胞，并以StraS及Prml為報告系統，獲得的類精細胞在注射入卵子后能獲得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干細胞在體外轉分化出了原始生殖細胞以及精原細胞樣的細胞。2009年，我國研究小組Yu等報導成功將小鼠干細胞誘導為精子。這項研究值得關注的是首次將高表達DAZL基因做為誘導配子的方案。2011年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干細胞，加上BMP4等誘導因子，分離出PGCs。在移植到睪丸后，獲得成熟精子，并獲得下一代小鼠。綜合最近研究進展，大都采用胚胎干細胞(ESC)作為原材料，但是ESC處在哺乳動物個體發育的早期，而且取材困難，因此采用成體干細胞代替ESC向生殖細胞分化可以更好地解決問題。毛囊干細胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能成體干細胞
發明內容
:本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法。本發明方法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊，體外培養毛囊干細胞，將傳代兩次的毛囊干細胞體外培養形成擬胚體(EB);然后以小鼠成纖維細胞(MEF)為飼養層，采用共培養的方式分化發育形成原始生殖細胞樣細胞，并具有與體內正常發育的原始生殖細胞相類似的形態和特異基因表達特征。為了實現上述發明目的，本發明方法按照如下步驟操作:第一步，利用機械法分離小鼠觸須部毛囊:用手術鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，轉移至磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0) +10%胎牛血清(FCS)的操作液中，在操作液中清洗，并去除與毛囊連接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪等雜質，在新鮮DMEM/F-12 (細胞培養液Dulbecco’sModified Eagle Medium, F-12 Nutrient Mixture)中將毛囊清洗；第二步，體外培養毛囊干細胞:毛囊經DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA, 37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化， 于DMEM/F-12中清洗，過400目細胞篩后轉入毛囊干細胞培養液培養，以培養當天為零代，每4天傳代一次；第三步，毛囊干細胞體外形成EB:當毛囊干細胞培養到第二代又3-4天時(即培養的11-12天)，離心收集細胞，棄上清，加入
0.25%Trypsin室溫消化5分鐘，然后輕輕吹打至單細胞，終止消化，Medium 199洗兩遍后轉入24孔板懸浮培養，置于EB培養基中培養；第四步，小鼠成纖維細胞(MEF)培養及飼養層細胞的制作:將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內臟、尾將軀干轉移至磷酸鹽緩沖液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，力口入10%胎牛血清(FCS)終止，轉入成纖維細胞培養基中培養，以培養當天為零代，細胞達90%匯合度時傳代；取1-3代成纖維細胞，倒掉培養基，加入含有10 μ g絲裂霉素C的成纖維細胞培養液，置于培養箱中1.5-2小時，取出用磷酸鹽緩沖液清洗，用0.25% Trypsin將貼壁的成纖維細胞消化下來，終止后DMEM高糖清洗，轉入24孔板貼壁培養；第五步，EB培養后與飼養層共培養向原始 生殖細胞(PGC)分化:用0.25% Trypsir^WtEB,室溫消化過程中用槍吹打至單細胞，用血清終止消化，收集細胞，離心；棄上清，加入PGC培養液懸浮細胞，將細胞稀釋到細胞濃度為5 X IO4個/ml PGCs培養液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細胞飼養層的24孔中加入0.5ml重懸的細胞，將培養板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養；培養液包括:DMEM 高糖，10% 胎牛血清(FCS)，0.23mM 丙酮酸鈉，0.1mM NEAA (Non-Essential AminoAcids,非必需氨基酸，Hyclone公司)，2mM L-谷氨酰胺,0.1mM β -巰基乙醇，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，40ng/ml干細胞生長因子(SCF)0本發明方法第二步所述毛囊干細胞培養液包含DMEM/F12，2% B-27，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，1%青鏈霉素。本發明方法第三步所述EB培養基包括Medium 199 (pH 7.0)，3mg/ml牛血清蛋白(BSA)，lmg/ml胎球蛋白，5ul/ml胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉(ITS)，0.23mM丙酮酸鈉，Ing/ml表皮生長因子(EGF)，5mIU/ml促卵泡素(FSH)，3mIU/ml促黃體素(LH)。本發明方法第四步所述成纖維細胞培養基包括:DMEM高糖、10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸鈉，1%NEAA，1%青鏈霉素。本發明方法成功利用機械法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊，體外培養毛囊干細胞(HFSC)，利用HFSC體外形成EB的方法進行分化，分化后與小鼠成纖維細胞采用共培養的方式進行誘導，獲得了與體內正常原始生殖細胞(PGC)形態和特異分子標記表達類似的PGC。


:圖1為出生后7天小鼠觸須部毛囊的分離顯微圖。圖2為小鼠毛囊干細胞體外培養顯微圖。圖3為傳代兩次的毛囊干細胞體外誘導形成EB顯微圖。圖4為小鼠成纖維細胞飼養層制作。圖5為毛囊干細胞經EB誘導后與MEF共培養向PGC分化的各時間段顯微圖。圖6為檢測毛囊干細胞分化的PGC是否表達正常PGC相關基因。圖7為毛囊干細胞分化的PGC進行免疫熒光組織化學染色。
具體實施方式
:下面結合附圖并通過具體實施例對本發明方法做進一步闡述。實施例1、1、小鼠毛囊的分離毛囊干細胞(HFSC)來源于出生后7天小鼠觸須部皮膚毛囊。用手術鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，見圖1中I，轉移至磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)+10%胎牛血清(FCS，Hyclone公司)的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術鑷子去掉與毛囊連接在一起的皮脂腺，立毛肌，脂肪等雜質，見圖1中2，在新鮮DMEM/F-12 (Hyclone公司)中將毛囊洗3次。2、毛囊干細胞的體 外培養毛囊經DMEM/F-12 (Hyclone 公司)洗完 3 遍后，置于 0.25%Trypsin_0.04%EDTA(Hyclone公司)，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F-12(Hyclone公司)中洗3遍，過400目細胞篩后轉入毛囊干細胞培養液培養，毛囊干細胞培養液包含 DMEM/F12(Hyc1ne 公司);2%B_27 (Gibco 公司);20ng/ml 表皮生長因子(EGF，Sigma公司)；40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF, Peprotech公司)；1%青鏈霉素(Hyclone公司)，以培養當天為零代，每4天傳代一次。圖2所示為小鼠毛囊干細胞體外培養顯微圖。圖2中I為過細胞篩后單細胞懸液，培養I天后有明顯細胞聚集物出現(圖2中2)，繼續培養3天后，克隆球變大，邊界清晰(圖2中3)，傳代I次后克隆的邊緣非常光滑緊湊，克隆呈一個個的球狀(圖2中4-5)，傳代兩次后細胞的克隆球數進一步增多(圖2中6)。3、毛囊干細胞體外形成擬胚體(EB)當毛囊干細胞培養到第二代又3-4天時(即培養的11-12天)，1500rpm離心5min收集細胞，棄上清，加入0.25%Trypsin (Hyclone公司)室溫消化5分鐘，然后輕輕吹打至單細胞，終止消化，Medium 199洗兩遍后轉入24孔板(SARSTEDT公司)懸浮培養，置于EB培養基中培養，EB培養基包括Medium 199 (Gibco公司，pH 7.0)，3mg/ml牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司)，lmg/ml胎球蛋白(Fetuin,Merck公司)，5ul/ml ITS (胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉Gibco公司),0.23mM丙酮酸鈉(Hyclone公司)，lng/ml表皮生長因子(EGF, Sigma公司)，5mIU/ml促卵泡素(FSH，Sigma公司)，3mIU/ml促黃體素(LH，Sigma公司)。圖3所示為傳代兩次的毛囊干細胞體外誘導形成EB顯微圖。圖3中I是將毛囊干細胞消化為單細胞，圖3中2是培養I天后形成的EB前體，經過2-3天后EB邊緣清晰并且變得光滑，呈不規則形狀(圖3中3-4)。4、小鼠成纖維細胞(MEF)培養及飼養層細胞的制作將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內臟、尾等將軀干轉移至磷酸鹽緩沖液清洗3遍，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，加入10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)終止，轉入成纖維細胞培養基中培養，成纖維培養基包括=DMEM高糖(Hyclone公司)、10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)，1%丙酮酸鈉(Hyclone公司)，1%NEAA (Hyclone公司)，1%青鏈霉素(Hyclone公司)；以培養當天為零代，細胞達90%匯合度時傳代；取1-3代成纖維細胞，倒掉培養基，加入4ml含有10 μ g絲裂霉素C(索來寶公司)的成纖維細胞培養液，置于培養箱中1.5-2小時，取出用磷酸鹽緩沖液洗5遍，用0.25% Trypsin (Hyclone公司)將貼壁的成纖維細胞消化下來，終止后DMEM高糖洗3遍，轉入24孔板貼壁培養。圖4中I為轉入24孔板12小時后的飼養層，細胞匯合率達到50%左右，圖4中2表示成纖維細胞為GFP陰性(為了與GFP陽性的PGC區別開來)。5、EB培養后與飼養層共培養向原始生殖細胞(PGC)分化用0.25%Trypsin (Hyclone公司)消化EB,室溫消化過程中用槍吹打至單細胞，用10%胎牛血清(FCS，Gibco-BRL)終止消化，收集細胞，1500rpm離心5min ;棄上清，加入少量PGC培養液懸浮細胞，將細胞稀釋到細胞濃度為5 X IO4個/ml PGCs培養液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細胞飼養層的24孔中加入0.5ml重懸的細胞，將培養板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養，培養液包括:DMEM高糖(Hyclone公司)，10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)，0.23mM 丙麗酸納(Hyclone 公司)，0.1mM NEAA (Hyclone 公司)，2mM L-谷氛酸胺，
0.1mMβ -巰基乙醇(sigma公司)，20ng/ml表皮生長因子(EGF, sigma公司),40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,Peprotech公司)，40ng/ml干細胞生長因子(SCF, sigma公司)。圖5中I為EB消化成的單細胞與底下鋪的飼養層共培養，圖5中2為I天后很多細胞貼壁，至IJ PGC分化的第5天，出現折光度大，“亮晶晶”的細胞(圖5中3)，這些細胞的數目隨著培養時間的增加，數目越來越多(圖5中4-6)。6、RT-PCR檢測分化的PGC生殖細胞特異基因表達定量PCR 運用 SYBR Premix Ex TaqTM kit (TaKaRa 公司)和 ABI 7300real-time PCR儀(Applied Biosystems),米用β-actin作為內參基因。檢測如下基因:Dazl, Fragllis, Stella, Figa, 0ct3/4, SCP3。圖 6 顯示在 PGC 分化過程中，PGC 特異基因Dazl, Blimpl, Stella在分化第4天表達較高，C_kit在第6天表達較高，vasa在第2天表達較高。體系如下:Mix 的配制:
權利要求
1.一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于按照如下步驟操作:第一步，分離小鼠觸須部毛囊:用手術鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，轉移至磷酸鹽緩沖液PH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除與毛囊連接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鮮細胞培養液DMEM/F-12中將毛囊清洗；第二步，體外培養毛囊干細胞:毛囊經DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，過400目細胞篩后轉入毛囊干細胞培養液培養，以培養當天為零代，每4天傳代一次；第三步，毛囊干細胞體外形成擬胚體EB:當毛囊干細胞培養到第二代又3-4天時，離心收集細胞，棄上清，加入0.25%Trypsin室溫消化5分鐘,然后輕輕吹打至單細胞,終止消化,Medium 199洗兩遍后轉入24孔板懸浮培養，置于EB培養基中培養；第四步，小鼠成纖維細胞培養及飼養層細胞的制作:將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內臟、尾將軀干轉移至磷酸鹽緩沖液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA, 37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，加入10%胎牛血清終止，轉入成纖維細胞培養基中培養，以培養當天為零代，細胞達90%匯合度時傳代；取1-3代成纖維細胞，倒掉培養基，加入含有10 μ g絲裂霉素C的成纖維細胞培養液，置于培養箱中1.5-2小時，取出用磷酸鹽緩沖液清洗，用0.25%Trypsin將貼壁的成纖維細胞消化下來，終止后DMEM高糖清洗，轉入24孔板貼壁培養；第五步，EB培養后與飼養層共培養向原始生殖細胞PGC分化:用0.25% Trypsin消化EB，室溫消化過程中用槍吹打至單細胞，用血清終止消化，收集細胞，離心 ；棄上清，加入PGC培養液懸浮細胞，將細胞稀釋到細胞濃度為5 X IO4個/ml PGCs培養液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細胞飼養層的24孔中加入0.5ml重懸的細胞，將培養板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養；培養液包括:DMEM高糖，10%胎牛血清，0.23mM 丙酮酸鈉,0.1mM Non-Essential Amino Acids, 2mM L-谷氨酸胺,0.1mM β-疏基乙醇，20ng/ml表皮生長因子，40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子，40ng/ml干細胞生長因子。
2.根據權利要求1所述的一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于第二步所述毛囊干細胞培養液包含DMEM/F12，2% B_27，20ng/ml表皮生長因子，40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子，1%青鏈霉素。
3.根據權利要求1所述的一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于第三步所述EB培養基包括pH 7.0的Medium 199，3mg/ml牛血清蛋白，Img/ml胎球蛋白，5ul/ml胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉，0.23mM丙酮酸鈉，lng/ml表皮生長因子，5mIU/ml促卵泡素，3mIU/ml促黃體素。
4.根據權利要求1所述的一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，其特征在于第四步所述成纖維細胞培養基包括:DMEM高糖、10%胎牛血清，1%丙酮酸鈉，l%Non-Essential Amino Acids, 1% 青鏈霉素。
全文摘要
本發明涉及一種小鼠毛囊干細胞體外向原始生殖細胞分化的技術方法，按照如下步驟操作第一步，利用機械法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊；第二步，體外培養毛囊干細胞毛囊經DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F-12中清洗，過400目細胞篩后轉入毛囊干細胞培養液培養；第三步，將傳代兩次的毛囊干細胞體外培養形成擬胚體EB；第四步，制作小鼠成纖維細胞培養及飼養層細胞；第五步，EB培養后與飼養層共培養向原始生殖細胞分化。本發明方法獲得了與體內正常原始生殖細胞形態和特異分子標記表達類似的原始生殖細胞。
文檔編號C12N5/076GK103146644SQ20131006066
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優先權日2013年2月27日
發明者孫源超, 陳波, 陳春雷, 沈偉 申請人:青島農業大學