專利名稱：MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及構建一種融合DNA疫苗，尤其涉及一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制備方法與應用。
背景技術：
目前，抗腫瘤血管生成成為抗腫瘤治療的一種有效手段，以激活細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)為主的主動免疫治療策略在惡性腫瘤的綜合治療占有重要的地位，以激發主動免疫的DNA疫苗是近年來成為研究最多的疫苗形式，由于其易于擴增和修飾諸多優點越來越受到人們的重視。DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質粒DNA (有時也可是RNA)，它可經一定途徑進入動物體內，被宿主細胞攝取后轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產生非特異性和特異性2種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。目前，腫瘤DNA疫苗可以采用融合疫苗形式增強抗原呈遞，采用聯合及靶向疫苗不僅可以增強抗原呈遞，還可以擴大免疫效應。融合疫苗，通常是利用其中一個分子與免疫識別或免疫應答密切相關，使之具有靶向呈遞作用，以促進免疫抗原呈遞，融合疫苗在抗原靶向呈遞上具有更強的優勢。腫瘤血管內皮標志物8(TEM8)因其在腫瘤中特異性表達，成為抗腫瘤血管生成的新型候選靶標之一，過去的實驗研究表明TEM8所構成的單獨的分子疫苗免疫原性較低，而與其他抗原結合以后可以有效的激發免疫反應，后來的學者在臨床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM8的免疫原性，抗瘤效果明顯。小鼠防御素_beta2 (MBD2)能夠有效趨化iDC， 本研究中我們設計了一個MBD2與鼠的TEM8構建成融合疫苗pMBD2_mTEM8疫苗，免疫荷有 CT-26的Balb/C小鼠，能夠有效的打破機體的免疫耐受，誘發機體產生針對腫瘤血管內皮細胞的免疫反應。

發明內容
本發明的目的在于是提供一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗，所述疫苗包含MBD2 基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。本發明的第二個目的在于是提供一種MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗的制備方法，其包含以下步驟1)獲取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過SEQ ID NO 5所示的連接肽連接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3. 1載體上，形成所述DNA融
合疫苗。本發明的第三個目的在于是提供一種MBD2_mTEM8融合蛋白表達載體，其包含 MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體，MBD2基因的序列如SEQ IDNO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。本發明的第四個目的是提供一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體的制備方法，其包含以下步驟1)獲取 MBD2 基因、mTEM8 基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過SEQ ID NO :5所示的連接肽連接，形成MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3. 1載體上，形成所述融合蛋白表達載體。所述的制備方法中步驟1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。所述的制備方法中所述MBD2基因通過化學合成，所述mTEM8基因通過SEQ ID NO: 2-3所示的引物從murine cDNA library通過PCR擴增獲得。所述的制備方法中步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ IDNO 8所示。本發明的第五個目的是提供一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體在制備DNA融合疫苗中的應用。本發明的第六個目的是提供一種DNA融合疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明提供所述MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，能夠有效的打破機體對mTEM8 的免疫耐受，誘發機體產生針對血管內皮細胞的細胞免疫反應，并產生免疫記憶。本發明所述疫苗制備方法簡單，且該融合DNA疫苗比傳統疫苗安全，具有明顯的抑制腫瘤生長的效果。本發明所述疫苗對研究其抗腫瘤血管生成的作用機制有著深刻的意義。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1是MBD2_mTEM8融合疫苗的陽性克隆的PCR鑒定示意圖；圖2是圖1的陽性克隆的正向測序和MTF序列比對結果；圖3是圖1的陽性克隆的反向測序結果和MTF序列的比對結果；圖4是MBD2-TEM8融合基因PCR產物的電泳圖；圖5是Western blot檢測融合基因的蛋白表達；圖6是DNA融合疫苗抗腫瘤效果，其中的A為皮下接種CT-26后小鼠的腫瘤體積的變化，B為皮下接種CT-26后的小鼠生存時間統計圖；C為皮下接種CT-26后腫瘤的示意圖；圖7是腫瘤組織內血管密度檢測結果；圖8是51Cr釋放實驗結果；圖9是IFN- y ELISpot檢測CTL活性結果；圖10是去除⑶8+T淋巴細胞亞群后對pMBD2-mTEM8疫苗抗腫 瘤作用的影響。
具體實施例方式實驗材料
7-8周齡雌性Balb/C小鼠，購于中國醫學科學院動物所。細胞培養液DMEM，RPMI1640，購自 Gibco-Invitrogen 公司。紅細胞裂解液(用KHCO3 1. 0g, NH4CL 8. 3g，EDTA :37mg，加雙蒸餾水至IL配置而成)。小鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)。51Cr (Chromium-51，51Cr)試劑(北京同位素公司)。 Triton X-100 (FARCO CHEMICAL Supplies 公司)。Y 干擾素(interferon-γ，IFN- γ )酶聯免疫斑點試驗(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)檢測試劑(荷蘭U-CyTech生物科技公司)?？耿?單克隆抗體購自Santa公司。mTEM8單克隆抗體購自Santa Cruz公司。凈化工作臺SW-CJ_IF(蘇州集團蘇州安泰空氣技術有限公司)。二氧化碳孵箱(美國Thermo Forma公司)。FT-603型、閃爍探頭和FH-461自動定標器(北京核儀器廠)。倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。SDS-PAGE電泳裝置和電轉儀器(BI0-RAD公司)。pCDNA3. 1 載體購自 Invitrogen 公司。實施例1目的基因片段的獲取1. MBD2基因通過化學合成(合成自Invitrogen公司):SEQ ID NO 1GAACTTGACCACTGCCACACCAATGGAGGGTACTGTGTCAGAGCCATTTGTCCTCCTTCTGCCAGGCGT CCTGGGAGCTGTTTCCCAGAGAAGAACCCCTGTTGCAAGTACATGAAA2. mTEM8 (AF378762)-SEQ ID NO :4 從 murine cDNA library 通過 PCR 擴增獲得，引物如下SEQID NO 2-3mTEM8 正向引物 5，-GGCCGCCGCGAGGATGGG-3，； (SEQ ID NO 2)mTEM8 反向引物 5，-GCACAGCAAATAAGTGTCTTCCAC-3，. (SEQ IDNO 3)PCR反應體系采用KODplus (Toyobo)擴增體系(50 μ 1)如下
權利要求
1.一種MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。
2.權利要求1所述的合疫苗的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取MBD2基因、mTEM8基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過SEQID NO 5所示的連接肽連接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3.1載體上，形成所述DNA融合疫田ο
3.權利要求1所述的MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。
4.一種MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體，其特征在于，包含MBD2基因、mTEM8基因，所述 MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3. 1載體上。
5.根據權利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體，其特征在于，所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ IDNO 4所示。
6.權利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取MBD2基因、mTEM8基因；2)將步驟1)所述MBD2基因、mTEM8基因通過SEQID NO 5所示的連接肽連接，形成 MBD2-mTEM8融合基因；3)將步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因連接到pcDNA3.1載體上，形成所述融合蛋白表達載體。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO 1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO 4所示。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述MBD2基因通過化學合成，所述 mTEM8基因通過SEQ ID NO :2_3所示的引物從murine cDNAlibrary通過PCR擴增獲得。
9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ ID NO 8所示。
10.權利要求4所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表達載體在制備DNA融合疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，其包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因連接于pcDNA3.1載體上。本發明提供，MBD2與mTEM的融合疫苗pMBD2-mTEM8，能夠有效的打破機體對mTEM8的免疫耐受，誘發機體產生針對血管內皮細胞的細胞免疫反應，并產生免疫記憶。本發明所述疫苗制備方法簡單，并且比傳統疫苗更安全。本發明所述疫苗對研究其抗腫瘤血管生成的作用機制有著深刻的意義。
文檔編號C12N15/85GK102178958SQ201110056429
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者劉平, 梁后杰, 潘鳳, 阮志華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院