專利名稱：提取蓮細胞核dna的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域中提取DNA的方法，尤其涉及一種提取蓮細胞核DNA 的方法；具體涉及了一種以蓮黃化苗葉片為材料、有效提取高質量蓮細胞核DNA的方法。
背景技術：
蓮，俗稱荷花，是被子植物中起源最早的植物之一，素有“活化石”之稱。它在我國的栽培歷史悠久，是重要的水生經濟作物，集食用、藥用、觀賞于一身。因蓮具有獨特的經濟、文化和觀賞價值，已引起了人們廣泛的重視，但就分子生物技術在蓮研究中的應用，目前主要集中在品種鑒定及演化關系分析、種質間遺傳多樣性評估等方面，還未開展深層次的蓮基因組學研究。隨著Illumina公司發布了新一代測序儀Genome Analyzer (Solexa產品系列)之后，Genome Analyzer作為新一代測序技術平臺，具有通量高、單位成本低、測序周期短和操作簡單等優點，是植物全基因組測序最經濟有效的測序平臺；但其對DNA質量有比較高的要求。DNA質量是基因組測序技術的基礎，分離純度高(少多糖、少多酚、少色素和蛋白質)、 葉綠體DNA和線粒體DNA含量低的核DNA，是測序儀高效和準確工作的基礎，也是使測序序列達到最高可用性的保證。CTAB (十六烷基三甲基溴化銨法)法是一種快速簡便的提取植物總DNA的常規方法(包括磨樣、裂解、萃取、沉淀DNA，去除RNA等過程)，但通過CTAB法所獲得的蓮DNA樣品含有較多的葉綠體DNA和線粒體DNA，而且雜質多、純度低，在很大程度上影響蓮基因組測序的均一性、無偏性和序列的有用性，從而最終影響序列的拼接質量，不適合用于蓮基因組測序。因此，需要一種新方法提取高質量的蓮細胞核DNA用于基于新一代測序技術的蓮基因組測序。

發明內容
本發明的目的就在于克服現有技術存在的問題和不足，提供一種提取蓮細胞核 DNA的方法。本發明的目的是這樣實現的一、提取蓮細胞核DNA的方法本方法包括下列步驟①稱取20克黑暗條件下培養的剔除葉柄的蓮黃化苗葉片，放置到經_20°C預冷 5-6小時的研缽中，再倒入適量的液氮，經快速研磨后得到細粉狀樣品；②將細粉狀樣品轉移至裝有200毫升、經4°C預冷1-2小時的細胞核提取緩沖液 Solution I的燒杯中，并在冰上用磁力攪拌器攪拌20分鐘，得攪拌混合液；③將攪拌混合液用兩層紗布和兩層Miracloth濾布(美國Caibiochem公司產品) 過濾后，收集濾液，并轉至50毫升離心管中，置于冷凍離心機上在4°C、ISOOrpm離心20分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為溶液，下層為白色沉淀物，棄去上層溶液；
④向白色沉淀物中加入40毫升Solution I緩沖液，輕輕晃動使之混合均勻，置于冷凍離心機上在4°C、ISOOrpm離心20分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為溶液狀，下層為白色沉淀物，棄去上層溶液；重復步驟④兩次，得到的白色沉淀物，即為純化的細胞核；⑤向純化細胞核內加入5毫升65°C的細胞核裂解緩沖液Solution II，并加入10 微升、濃度為10mg/ml的核糖核酸酶(RNase)溶液，輕輕轉動使之混合均勻，在65°C的水浴鍋中放置30分鐘，期間上下顛倒混合一次，得混合液；⑥向混合液中加入5毫升的氯仿異戊醇=體積比為M 1的萃取液，上下顛倒混勻，然后在室溫下靜置5分鐘，再于離心機上12000rpm離心15分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為水相，下層為有機相；⑦吸取上層水相至另一 50毫升離心管中，并加入4毫升的異丙醇，輕輕搖動混勻， 再置于-20°C的冰柜中30分鐘，沉淀出絮狀的蓮細胞核DNA ；⑧用牙簽挑出絮狀的DNA沉淀物至另一容量為2毫升的離心管中，加入1毫升 70%乙醇洗滌液，輕輕搖動以充分洗滌DNA沉淀物，然后傾斜離心管，小心倒出洗滌液；⑨再次加入1毫升70%乙醇洗滌液，對DNA沉淀物進行洗滌，然后傾斜離心管，小心倒出洗滌液，將離心管放置于超凈工作臺上3-4小時，以吹干離心管內殘留的乙醇洗滌液，并干燥DNA沉淀物；⑩向離心管中加200微升的Tris-EDTA(三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，輕輕搖動至DNA沉淀物充分溶解，然后將離心管放入-20°C冰柜中保存。工作原理經液氮研磨的蓮黃化苗葉片用細胞核提取緩沖液提取和純化細胞核，加入細胞核裂解緩沖液在65°C下裂解細胞核，再經過氯仿異戊醇的萃取、異丙醇的沉淀，得到絮狀的 DNA沉淀，最后利用70%乙醇的洗滌DNA沉淀，即得高質量的蓮細胞核DNA。本發明可分離到高純度(少多糖、少多酚、少色素和蛋白質)、低葉綠體DNA和線粒體DNA含量的細胞核 DNA，滿足蓮基因組測序與研究所需要的高質量細胞核DNA。實驗證明，通過本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果①通過本發明所獲得的DNA為蓮細胞核DNA，葉綠素DNA和線粒體DNA含量低；②通過本發明所獲得的蓮細胞核DNA質量和純度高，所含多糖、多酚、色素和蛋白質少。③本發明適用于構建BAC文庫和基因組測序等方面所需高質量細胞核DNA的提取。
具體實施例方式一、兩種緩沖液1、細胞核提取緩沖液Solution I(1)細胞核提取緩沖液Solution I的組分
5三羥甲基氨基甲烷(Tris-base) 乙二胺四乙酸(EDTA) 氯化鉀(KCl) 蔴糖(Sucrose)
聚乙二醇辛基苯基醚(iTritonX-IOO) 聚乙烯醇吡咯烷酮-30 (PVP-30) 亞精胺(Spermidine) 精胺(Spermine)
β -巰基乙醇(β -Mercaptoethanol)
2%；
1毫摩爾/升; 1毫摩爾/升; 0. 15% O
10毫摩爾/升; 10毫摩爾/升； 80毫摩爾/升； 0.5摩爾/升；(2)細胞核提取緩沖液Solution I的制備方法①前5種組分溶解和混合后，將pH調至9. 4-9. 5，然后置于滅菌瓶中在121 °C、 0. IMpa滅菌12-16分鐘；②加入后4種組分混合；③密封備用。2、細胞核裂解緩沖液Solution II(1)細胞核裂解緩沖液Solution II的組分(2)細胞核裂解緩沖液Solution II的制備方法①前6種組分溶解和混合后，將pH調至7. 9-8. 0，然后置于滅菌瓶中在121 °C、 0. IMpa滅菌20分鐘；②加入最后1種組分混合；③密封備用。二、實驗結果將通過本發明獲得的蓮細胞核DNA和通過CTAB常規法獲得的蓮基因組DNA分別置于紫外分光光度計(型號為Ultrospec 1100)上測定其在波長260納米、230納米和觀0 納米的吸光值，并比較兩種方法所得DNA的A260/A280和A260/A230的比值，結果見下表
三羥甲基氨基甲烷(Tris-base) 乙二胺四乙酸(EDTA) 山梨糖醇(Sorbitol) 氯化納(NaCl) 十二烷基硫酸鈉(SDS) 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) β -巰基乙醇(β -Mercaptoethanol)
50毫摩爾/升； 5毫摩爾/升； 350毫摩爾/升; 710毫摩爾/升;
權利要求
1.提取蓮細胞核DNA的方法，其特征在于下列步驟①稱取20克黑暗條件下培養的剔除葉柄的蓮黃化苗葉片，放置到經_20°C預冷5-6小時的研缽中，再倒入適量的液氮，經快速研磨后得到細粉狀樣品；②將細粉狀樣品轉移至裝有200毫升、4°C預冷1-2小時的細胞核提取緩沖液 Solution I的燒杯中，并在冰上用磁力攪拌器攪拌20分鐘，得攪拌混合液；③將攪拌混合液用兩層紗布和兩層Miracloth濾布過濾后，收集濾液，并轉至50毫升離心管中，置于冷凍離心機上在4°C、1800 rpm離心20分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為溶液，下層為白色沉淀物，棄去上層溶液；④向白色沉淀物中加入40毫升SolutionI緩沖液，輕輕晃動使之混合均勻，置于冷凍離心機上在4°C、1800 rpm離心20分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為溶液狀，下層為白色沉淀物，棄去上層溶液；重復步驟④兩次，得到的白色沉淀物，即為純化的細胞核；⑤向純化細胞核內加入5毫升65°C的細胞核裂解緩沖液SolutionII，并加入10微升、 濃度為10mg/ml的核糖核酸酶溶液，輕輕轉動使之混合均勻，在65°C的水浴鍋中放置30分鐘，期間上下顛倒混合一次，得混合液；⑥向混合液中加入5毫升的氯仿異戊醇萃取液，上下顛倒混勻，然后在室溫下靜置5 分鐘，再于離心機上12000 rpm離心15分鐘，離心管內溶液上下分層，上層為水相，下層為有機相；⑦吸取上層水相至另一50毫升離心管中，并加入4毫升的異丙醇，輕輕搖動混勻，再置于-20°C的冰柜中30分鐘，沉淀出絮狀的蓮細胞核DNA ；⑧用牙簽挑出絮狀的DNA沉淀物至另一容量為2毫升的離心管中，加入1毫升70%乙醇洗滌液，輕輕搖動以充分洗滌DNA沉淀物，然后傾斜離心管，小心倒出洗滌液；⑨再次加入1毫升70%乙醇洗滌液，對DNA沉淀物進行洗滌，然后傾斜離心管，小心倒出洗滌液，將離心管放置于超凈工作臺上3-4小時，以吹干離心管內殘留的乙醇洗滌液，并干燥DNA沉淀物；⑩向離心管中加200微升的Tris-EDTA緩沖液，輕輕搖動至DNA沉淀物充分溶解，然后將離心管放入_20°C冰柜中保存；其中細胞核提取緩沖液Solution I的組分三羥甲基氨基甲烷10毫摩爾/升乙二胺四乙酸10毫摩爾,/升氯化鉀80毫摩爾./升蔗糖0. 5摩爾/'升;聚乙二醇辛基苯基醚0. 5% ；亞精胺1毫摩爾/升；精胺1毫摩爾/升；聚乙烯醇吡咯烷酮-302% ；β-巰基乙醇0. 15% ；pH 為 9. 4-9. 5 ；細胞核裂解緩沖液Solution II的組分三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸山梨糖醇氯化納十二烷基硫酸鈉十六烷基三甲基溴化銨 β-巰基乙醇 ρΗ 為 7. 9-8. 0。50毫摩爾/升； 5毫摩爾/升； 350毫摩爾/升 710毫摩爾/升 1% ； 0. 1% ； 0. 1% ；
全文摘要
本發明公開了一種提取蓮細胞核DNA的方法；涉及分子生物學領域中提取DNA的方法。其主要步驟是向研磨成細粉狀的蓮黃化苗葉片中加入細胞核提取緩沖液，經磁力攪拌、過濾、離心、漂洗后，得到純化細胞核；加入細胞核裂解緩沖液于65℃水浴，經氯仿異戊醇萃取和異丙醇沉淀后，得到絮狀DNA沉淀物；經70%乙醇洗滌和室溫干燥后，加Tris-EDTA緩沖液溶解DNA，于-20℃保存備用。通過本發明所獲得的DNA為高質量的蓮細胞核DNA，葉綠素DNA和線粒體DNA含量低，所含多糖、多酚、色素和蛋白質少。本發明適用于構建BAC文庫和基因組測序等方面所需高質量細胞核DNA的提取。
文檔編號C12N15/10GK102206629SQ20111008754
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月6日 優先權日2011年4月6日
發明者劉艷玲, 徐立銘, 楊美 申請人:中國科學院武漢植物園