專利名稱：一種提取梨花粉管細胞核的方法
技術領域：
本發 明屬于植物生物化學領域，涉及一種提取梨花粉管細胞核的方法，具體涉及一種利用細胞化學處理及亞細胞器分級篩選技術從梨花粉管中提取純化細胞核的方法。
背景技術：
細胞核幾乎含有所有的遺傳信息，對基因表達和調控極其重要。隨著基因組測序的發展，DNA纖維熒光原位雜交及大片段基因組文庫的構建對植物全基因組測序具有重要推動作用。而提取純化的細胞核是制作DNA纖維和構建大片段基因組文庫的基礎。細胞核除了含有DNA和RNA外，還含有一些蛋白質，并且這些蛋白隨著胞內及胞外環境不同呈現出動態變化，從而參與不同的細胞行為調控。這些蛋白涉及信號轉導、基因調控、蛋白水解及程序性細胞死亡(programmed cell death，P⑶)等。因此提取純化細胞核對于從基因組及蛋白質組學水平研究其生理調控機制具有重要意義。目前細胞核提取技術多數采用傳統研磨植物組織或是先通過酶解法提取原生質體，然后經綢布過濾、離心獲得細胞核，如大豆下胚軸組織(1981)、爬山虎冠癭瘤愈傷組織 (1981)、大豆SB-I細胞系(1988)、蒜瓣(1990)細胞核提取。此外，棉花子葉(2009)細胞核提取技術主要采用刀片將子葉切成碎釋放細胞核，并通過濾膜過濾獲得細胞核。梨花粉管是一種特殊的植物細胞，添加提取液后采用傳統的研缽研磨手段難以完全將花粉管破壁， 讓細胞核隨著胞質釋放。同時采用傳統的液氮研磨會將細胞器損壞，不適宜細胞核分離。而預先提取花粉管原生質體后再破壁提取細胞核，需要大量的纖維素酶、離析酶等，成本高， 步驟復雜。細胞研磨液過濾后直接離心，純化效果不佳，往往含有大量雜質。而密度離心具有較好的效果，但是傳統的蔗糖等密度梯度不好控制，純化得到的細胞核質量不佳。目前細胞核提取技術有許多不足，且不適宜花粉管細胞核提取，因此建立一套花粉管細胞核提取純化技術對于研究梨花粉管生長代謝及自交不親和反應具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種提取梨花粉管細胞核的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案實現一種提取梨花粉管細胞核的方法，該方法包括以下步驟1)采集花粉采集大蕾期花藥，干燥；干燥方法有多種可以采用白熾燈照射或干燥硅膠陰干等。2)花粉培養分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養基中，避光條件下， 25 28°C，140 180rpm，培養 3 4h ；3)細胞核的釋放將培養好的花粉連同培養基倒入孔徑為50 μ m的細胞篩a內， 并使培養基通過細胞篩流出，迅速在細胞篩a底部加一個孔徑為40 μ m的細胞篩b，將兩個細胞篩放置于比其直徑稍大的培養皿上，迅速將細胞核研磨液加入到細胞篩a中，用玻璃研棒以60 IOOrpm速度研磨，同時再次添加細胞核研磨液使釋放的細胞核不斷流出經細胞篩b過濾到培養 皿中，以上操作均在4°C下進行；4)細胞核純化將步驟3)所述培養皿中得到的液體加入到離心管中，在漩渦儀上微震動20 40秒，迅速離心(200g，4°C，5min)得上清即為粗細胞核；將上清液轉移到 Percoll (乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒)密度梯度工作液頂部離心(3500g，4°C，25min)；離心后，Percoll密度梯度工作液頂部為淡黃色的細胞質，底部沉淀為純化的細胞核；5)Percoll的去除將純化的細胞核懸浮于細胞核研磨液進行洗滌，并迅速離心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即為純化后去除Percoll的梨花粉管細胞核，用研磨液懸浮備用。上述的提取梨花粉管細胞核的方法，所述的花粉培養基配方為100g/L蔗糖， 0. 3g/LCa (NO3) 2 · 4H20，30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸鈉)，150g/L PEG 4000 (聚乙二醇 4000), 0. lg/L硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris堿調整pH值至5. 8 6. 5。上述的提取梨花粉管細胞核的方法，所述的細胞核研磨液配方為0.3M蔗糖， IOmMNaCl (氯化鈉)，IOmM MES ( α -磺基甲脂磺酸鈉)，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0. 2mM 精胺，0. 5mM亞精胺，0. 2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，5mM DTT (二硫蘇糖醇)，0. 2 % (ν/ν) Triton-X-100,以 NaOH(氫氧化鈉)調整 pH 至 6. 0。上述的提取梨花粉管細胞核的方法，所述Percoll密度梯度工作液的配方為將 percoll 溶于 IOmM MES-NaOH(pH6. 0)緩沖液中制成 28. 5% (ν/ν)的 percoll 溶液，所述 MES-NaOH(pH6. 0)緩沖液中包含 0. 25M 蔗糖，IOmM NaCl, 3mM EDTA，0. 2mM PMSF，3mMDTT。1)關鍵技術提取植物細胞核關鍵是將其從細胞中釋放出來，然后進行提純。本發明采用了單細胞研磨及雙細胞篩過濾方法釋放細胞核，并通過梯度及percoll (乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒)密度離心得到質量較高的梨花粉管細胞核。細胞篩a和細胞篩b的孔徑組合對技術方案的效果影響較大。細胞篩a作用為研磨及過濾，若其孔徑大于50 μ m，會導致有些花粉管漏掉，從而不能確保更多的花粉管破裂釋放細胞核，影響提取細胞核的量；若小于50 μ m,會導致已釋放的細胞核未過濾至細胞篩 b而被再次研磨，影響提取細胞核的完整性。細胞篩b的作用為再次過濾已釋放的細胞核， 使其更純凈。若其孔徑大于40 μ m,則過濾后的細胞核含雜質較多，若小于40 μ m,則過濾細胞核不完全，影響提取細胞核的量。本發明技術方案中，僅用50mg花粉，采用孔徑為50μπι 的細胞篩a和孔徑為40 μ m的細胞篩b組合可提取860 μ g且純度高的梨花粉管細胞核。2)實施方案我們采用了單細胞篩研磨及雙細胞篩過濾技術對細胞核進行釋放并過濾雜質，然后再進行梯度和percoll密度離心步驟進行純化細胞核。以DNA特異性熒光探針DAPI ( 二脒基苯基吲哚)染色，熒光顯微鏡觀察得到的細胞核完整性，以及測定細胞質標志性酶(乙醇脫氫酶，ADH)檢測細胞核純度。該技術方案主要包括花粉培養，細胞篩研磨過濾細胞核，percoll密度離心，清洗percoll，提取細胞核完整性及純度檢測(見圖1)。本發明的有益效果(1)該發明采用單細胞篩研磨和雙細胞篩過濾釋放梨花粉管細胞核并濾除雜質， 僅用50mg花粉便可提取860 μ g且高質量的梨花粉管細胞核。該方法不涉及酶解提取原生質體，及傳統研磨過濾技術。這種細胞核釋放技術比傳統方法具有許多優點，如節省植物材料、操作簡便、快捷、成本低等。(2)該方法采用percoll密度離心技術結合梯度離心純化梨花粉管細胞核。 Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，形成密度梯度穩定，不穿透細胞膜，對細胞無毒害。本技術采用了 28.5%的percoll溶液得到了較高純度的梨花粉管細胞核。

(3)該方法提純后的細胞核幾乎沒有細胞質部分污染，不僅可以應用DNA纖維制備，還可以應用于細胞核蛋白質組學研究，為細胞核分子生物學及蛋白質組研究提供保障。(4)該方法不僅適用于梨花粉管細胞核提取純化，同時還可以為其他植物組織及花粉管細胞核提取提供重要參考。


圖1為梨花粉管細胞核提取技術方案簡圖。圖2為單細胞篩研磨雙細胞篩過濾。a為孔徑50 μ m細胞篩，b為孔徑40 μ m細胞篩，Bar = 1cm。圖3為提取前梨花粉管細胞核DAPI染色。箭頭所指為細胞核，a為熒光圖，b為明場圖，Bar = 20 μ m。圖4為提取純化后梨花粉管細胞核DAPI染色檢測細胞核完整性。箭頭所指為細胞核，a為熒光圖，b為明場圖，Bar = 20 μ m。圖5為梨花粉管細胞核提取物中ADH酶活性檢測。以本方法獲得的細胞質提取物為對照，細胞質部分ADH含量為 28. eSnmolmir^mg—protein，而細胞核部分 ADH 含量僅為 0. g^molmir^mg—protein。
具體實施例方式1)采集花粉采集大蕾期花藥，用白熾燈照射干燥。2)花粉培養分離干燥花藥中的花粉，取50mg花粉，將其加入到50ml花粉培養基中，避光條件下，25 28°C，140 180rpm，培養3 4h ；花粉培養基的配方100g/L蔗糖，0. 3g/LCa (NO3) 2 · 4H20，30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸鈉)，150g/L PEG 4000 (聚乙二醇 4000), 0. lg/L硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris堿調整pH值至5. 8 6. 5。3)細胞核的釋放將培養好的花粉連同培養基倒入孔徑為50 μ m的細胞篩a內， 并使培養基通過細胞篩流出，迅速在細胞篩a底部加一個孔徑為40 μ m的細胞篩b，將兩個細胞篩放置于比其直徑稍大的培養皿上，迅速將細胞核研磨液加入到細胞篩a中，用玻璃研棒以90rpm速度研磨，同時再次添加細胞核研磨液使釋放的細胞核不斷流出經細胞篩b 過濾到培養皿中(如圖2所示)，以上操作均在4°C下進行；細胞核研磨提取液的配制0.3M蔗糖，IOmM NaCl (氯化鈉)，IOmM MES(α-磺基甲脂磺酸鈉)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0· 2mM精胺，0. 5mM亞精胺，0. 2mM PMSF (苯甲基磺酰氟)，5mM DTT ( 二硫蘇糖醇),0.2% (v/v) Triton-X-100,以NaOH (氫氧化鈉)調整pH至 6. 0。4)細胞核純化將步驟3)所述培養皿中得到的液體加入到離心管中，在漩渦儀上微震動30秒，迅速離心(200g，4°C，5min)得上清即為粗細胞核；將上清液轉移到Percoll 密度梯度工作液頂部離心(3500g，4°C，25min)；離心后，Percoll密度梯度工作液頂部為淡黃色的細胞質，中間為其他雜質，底部沉淀為純化的細胞核；所述Percoll密度梯度工作液的配方為Jfpercoll溶于IOmM MES-NaOH (ρΗ6. 0) 緩沖液中制成28. 5% (ν/ν)的percoll溶液，所述MES-NaOH(ρΗ6· 0)緩沖液中包含0. 25Μ 蔗糖，IOmMNaCl，3mMEDTA，0. 2mMPMSF, 3mMDTT。 5)Percoll的去除將純化的細胞核懸浮于細胞核研磨液進行洗滌，并迅速離心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即為純化后去除Percoll的梨花粉管細胞核，用研磨液懸浮備用。6)細胞核完整性檢測取100 μ 1純化得到的梨花粉管細胞核，加入終濃度為 0. 05 μ g/ml的DAPI，進行染色，同時取200 μ 1已培養好的花粉管以同樣條件用DAPI染色， 作為對照。并用熒光顯微鏡(Zeiss Axioakop40)觀察拍照(見圖3、4)。與對照相比，提純后的梨花粉管細胞核具有較好的完整性。7)細胞核純度檢測將提取純化后的細胞核用200 μ 1細胞核抽提液(25mM磷酸緩沖液，PH7. 8，40mM KCl，200g/L甘油，15g/L植物蛋白酶抑制劑混合物，0. 5M (NH4) 2S04) 冰浴251^11，1300(^，41，離心301^11，上清即為細胞核提取物。測定細胞核提取物和細胞質中的乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)活性，以檢測提取細胞核的純度。ADH 活性參照Kimmererk 1987方法測定。ADH為細胞質部分的標志酶，檢測細胞核提取物中該酶的活性以判斷提取純化梨花粉管細胞核的純度。以本方法獲得的細胞質提取物為對照，細胞質部分ADH含量為28. eSnmolmin^W'protein,而細胞核部分ADH含量僅為 0. g^molmir^mgHprotein(見圖5)。表明純化后細胞核部分胞質等組分很少，提純效果明顯。
權利要求
1.一種提取梨花粉管細胞核的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)采集花粉采集大蕾期花藥，干燥；2)花粉培養分離干燥花藥中的花粉，將其加入到花粉培養基中，避光條件下，25 28 0C，140 180rpm，培養 3 4h ；3)細胞核的釋放將培養好的花粉連同培養基倒入孔徑為50μ m的細胞篩a內，并使培養基通過細胞篩流出，迅速在細胞篩a底部加一個孔徑為40 μ m的細胞篩b，將兩個細胞篩放置于比其直徑稍大的培養皿上，迅速將細胞核研磨液加入到細胞篩a中，用玻璃研棒以60 IOOrpm速度研磨，同時再次添加細胞核研磨液使釋放的細胞核不斷流出經細胞篩 b過濾到培養皿中，以上操作均在4°C下進行；4)細胞核純化將步驟3)所述培養皿中得到的液體加入到離心管中，在漩渦儀上微震動20 40秒，迅速離心(200g，4°C，5min)得上清即為粗細胞核；將上清液轉移到Percoll 密度梯度工作液頂部離心(3500g，4°C，25min)；離心后，Percoll密度梯度工作液頂部為淡黃色的細胞質，底部沉淀為純化的細胞核； 5)Percoll的去除將純化的細胞核懸浮于細胞核研磨液進行洗滌，并迅速離心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即為純化后去除Percoll的梨花粉管細胞核，用研磨液懸浮備用。
2.根據權利要求1所述的提取梨花粉管細胞核的方法，其特征在于所述的花粉培養基配方為:100g/L 蔗糖，0. 3g/LCa (NO3)2 ·4Η20，30πιΜ MES, 150g/L PEG 4000,0. lg/L 硼酸溶于蒸餾水中并定容，用Tris堿調整pH值至5. 8 6. 5。
3.根據權利要求1所述的提取梨花粉管細胞核的方法，其特征在于所述的細胞核研磨液配方為0.3M 蔗糖，IOmM NaCl, IOmM MES, 5mM EDTA，0. 2mM 精胺，0. 5mM 亞精胺，0. 2mM PMSF, 5mM DTT,0. 2% (v/v) Triton-X-100，以 NaOH 調整 pH 至 6. 0。
4.根據權利要求1所述的提取梨花粉管細胞核的方法，其特征在于Percoll密度梯度工作液的配方為將percoll溶于IOmM MES-NaOH(ρΗ6· 0)緩沖液中制成28. 5% (ν/ν) 的 percoll 溶液，所述 MES-NaOH(pH6. 0)緩沖液中包含 0. 25M 蔗糖，IOmM NaCl, 3mMEDTA, 0. 2mMPMSF，3mMDTT。
全文摘要
本發明公開了一種提取梨花粉管細胞核的方法，包括以下步驟1)采集花粉采集大蕾期花藥，干燥；2)花粉培養；3)細胞核的釋放單細胞篩研磨和雙細胞篩過濾釋放細胞核；4)細胞核純化采用Percoll密度梯度離心；5)清洗Percoll。該方法不涉及酶解提取原生質體，及傳統研磨過濾技術。該方法具有操作簡便、快捷、成本低、提純效果明顯等優點。提純后的細胞核幾乎沒有細胞質部分污染，不僅可以應用DNA纖維制備，還可以應用于細胞核蛋白質組學研究，對于研究梨花粉管生長代謝及自交不親和反應具有重要的意義。
文檔編號C12N5/04GK102443564SQ20111040296
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者吳俊 , 周宏勝, 張紹鈴, 王春雷, 陶書田, 高永彬, 齊開杰 申請人:南京農業大學