大白菜細胞質雄性不育育性恢復基因的分子標記及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記及其應用，該與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記是位于大白菜CMS7311育性恢復基因兩側并與其緊密連鎖的InDel78標記和恢復系序列SCAR42標記，其中分子標記InDel78和SCAR42與育性恢復基因的遺傳距離分別為0.91cM和0.92cM，將育性恢復基因限定于大白菜A09染色體一個337kb的范圍內。這兩個分子標記不僅可應用于大白菜CMS7311育性恢復基因的分子標記輔助選擇，提高選擇效率，加快育種進程；也為進一步的育性恢復基因的圖位克隆、揭示細胞質雄性不育及其育性恢復的分子機制奠定基礎。
【專利說明】大白菜細胞質雄性不育育性恢復基因的分子標記及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業的植物分子標記輔助育種領域，涉及與一種大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記及應用。
【背景技術】
[0002]大白菜(Brassicacampestris L.ssp.pekinensis (Lour.) Olsson)是十字花科蕓薹屬白菜種中最重要的蔬菜作物之一，原產中國，是我國乃至世界性大宗蔬菜。早在上世紀90年代，陜西省農業科學院蔬菜花卉研究所就通過種間雜交及回交技術把甘藍型油菜CMS中轉育至大白菜育成CMS7311(張魯剛，郝東方，結球白菜溫度敏感細胞質雄性不育系CMS7311育性轉化的研究，植物學報，2001，43 (11):1123-1128)，進一步研究確認該CMS也含有異常的開放閱讀框0RF224，并帶有部分溫敏特性；并在大白菜找到可恢復CMS育性的恢復系，確定恢復基因為單基因遺傳。由于傳統的育性表型選擇要等到開花，通過田間直接觀察完成。對于攜帶恢復基因的優良材料，要將其轉育為不育系，必須經過雜交，自交，同時用不育系測交判斷其基因型等過程，操作起來費時費力，周期長，育種進程慢。為了加快大白菜胞質雄性不育育種速度，采用現代生物技術，進行分子標記輔助育種十分迫切。

【發明內容】
[0003]本發明的目的在于，提供一種大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記，其中:
[0004](I)提供大白菜CMS7311育性恢復基因的InDel標記和SCAR標記各I個；
[0005](2)提供InDel標記和SCAR標記的PCR引物序列；
[0006](3)提供對大白菜細胞質雄性不育及其育性恢復基因進行輔助選擇過程中對上述標記進行應用的方法。
[0007]為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案:
[0008]一種與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于，所述的與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記是與位于大白菜CMS7311育性恢復基因兩側并與其緊密連鎖的InDel78標記和恢復系序列SCAR42標記，其中，InDel78標記由恢復系序列InDel78F和不育系序列InDel78S組成；
[0009]所述的恢復系序列InDel78F大小為1146bp，具體序列如下:
[0010]5-ATCATATCCTGTCTATTTCGTGCTTCTCCTAAAAGAGTGATCTTAAGACCCAATCATCATGAGAATGTTTCTAGCTCTCTTCCTTCTCTTGGCCTTGACCACATCTTCAAGTAAGTACCTTTCTTCTCTTCTTGGTATACGGTCCAATAACAGTATTTAAGATTTTATTTCTATGTCTTTCTTTCTCTCTAGATGCAACTTACTGCCTCTGCAAAGATGGGACAGAAGACAACGCACTTCAAGCATCAATAGACTATGTTTGTGGAAAATTAGATTGCAACCCAATCCTTGACAAGGGTGCTTGTTATCAACCAAACACCATCAAAAGCCACTGTGATTGGGCTGTTAACAGCTACTTCCAGAATGTAGCTCAAGCCCCTGGAAGCTGCGACTTCTCTGGAACTGCCACTACCAGTCAAAACCCACCTSCATGTAAGTAAAAAAGTTTACATTTTGATGCGAAAAGTTGTGGTCTTGATGAGGTTCTTTTGTGCAGATTTGGTTACCGGATGTGTCTATCCTTCAAGCG
【權利要求】
1.一種與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于，所述的與大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記是與位于大白菜CMS7311育性恢復基因兩側并與其緊密連鎖的InDel78標記和恢復系序列SCAR42標記，其中，InDel78標記由恢復系序列InDel78F和不育系序列InDel78S組成； 所述的恢復系序列InDel78F大小為1146bp，具體序列如下:

2.如權利要求1所述的大白菜細胞質雄性不育可育基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于，所述的恢復系序列InDel78F、不育系序列InDel78S和恢復系序列SCAR42標記的PCR特異性擴增引物的序列如下:
ID78F:5-ATCATATCCTGTCTATTTCGTGCT-3 ；
ID78R:5-GTTATAACGAGGCACATAGGTTTC-3 ；
SC42F1: 5-GGACCAACTATACTTATCCTGTTACT-3 ；
P42R: 5-ACTAATGTTTCCGTAGCAATCT-3。
3.權利要
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，具體方法是: (1)用CTAB法提取待測材料基因組DNA；
(2)PCR 擴增:a、反應體系為25ul體系，各組分物質的含量分別為:20ng模板DNA；`2.5ul 10 Xbuffer ；1.8mM MgCl2 ；0.25mmol/L dNTP ;lpmol/L 引物:1.5U Taq DNA 聚合酶;ddH20補齊至25ul,混勻，離心； b、PCR擴增程序:預變性 94°C /5min，然后 94°C /60s,56°C /45s,72°C /lmin，35 個循環后，72 °C 延伸 5min ； c、電泳:取6ul的PCR擴增產物與2ul的6Xloading buffer混勻，點入0.8%的瓊脂糖凝膠中，150V電壓下電泳25min，經EB染色后在凝膠成像儀中觀察拍照； d、判斷: 在使用引物ID78F/ID78R擴增出1146bp的目的條帶，則該材料帶有大白菜CMS育性恢復基因的概率為99.09% ； 在使用引物SC42F1/P42R擴增出458bp的目的條帶，則該材料帶有大白菜CMS育性恢復基因的概率為99.08%以上； 如果兩對引物分別同時擴增出目的條帶，則待測材料具有大白菜CMS育性恢復基因的概率為100%。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981177SQ201410165808
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】張魯剛, 許小勇, 張玉 申請人:西北農林科技大學