專利名稱：一種CdSe/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法
技術領域：
本發明涉及納米技術在植物轉基因領域中的應用技術，具體涉及一種Cdk/ZnS 量子點與植物細胞的共孵育方法。
背景技術：
量子點(quantum dots，QDS)作為半導體熒光納米顆粒，具有熒光發射波長可調、 激發光譜寬而連續、熒光量子產率高等特點，且可經受多次激發，實現一元激發多元發射； 尤其熒光性質穩定，在某些情況下其發光時間是有機染料分子的100倍。憑借這些獨特優勢，量子點探針技術在生命科學領域中，越來越受到人們的青睞。盡管在醫學和動物實驗上應用已比較成熟，但其在植物細胞中的應用還處于起始階段，主要集中在(1)對植物細胞進行動態標記，追蹤其動力學過程；(2)對靶分子進行標記，研究其在細胞內生物功能的實現情況；(3)充當非病毒納米基因載體，建立高效的植物細胞轉基因體系；(4)同時作為質粒DNA的生物標記，對植物轉基因過程進行跟蹤和機理揭示。對于上述這些應用，都需要通過對量子點納米顆粒和植物細胞相互作用機制的了解來實現。所以研究它們的相互作用的細胞生物學特征，并實現其過程的有效調控，逐漸成為人們研究的熱點。相對于動物細胞， 植物細胞具有致密細胞壁，使納米顆粒導入細胞內的難度增加。為避開細胞壁的阻礙，人們常通過分離的植物細胞的原生質體為生物材料，研究其和納米顆粒之間的相互作用。但隨著納米技術的發展，有關于利用植物細胞的胞吞作用，將碳納米管導入完整植物細胞的研究報道。但利用表面修飾后的Cdk/ZnS納米顆粒穿過植物壁進入細胞內的研究未見報道。 同時利用CdS或CcKe等量子點材料作用于活體細胞的另一個問題是，CdS或CcKe等量子點材料會分解釋放出有毒重金屬離子Cd2+，結合線粒體蛋白質內巰基后，使蛋白失活。因此， 量子點表面涂層降解后的潛在生物毒性也不容忽視。但量子點材料對植物細胞毒理的研究尚未見報道。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種Cdk/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法，以通過研究植物懸浮細胞與經不同條件表面化學修飾的納米顆粒，在不同的共培養條件下相互作用的細胞生物學特征和細胞毒性等影響，為植物基因工程提供新型的無機納米基因載體和轉基因技術體系。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種CcKe/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法取1 IOmL濃度為廣5 X IO5個/mL 鵝掌楸單細胞懸浮液，放置于離心管中，加入10 50 μ L濃度為1 6 μ mol/L的Cdk/ZnS 水溶性量子點，控溫20 37°C，5(Tl00r/min，搖床培養3 9h ；200(T4000r/m離心5 lOmin，棄上清，用細胞培養液洗去未被細胞內吞的Cdk/ZnS量子點，即可。所述的CcKe/ZnS量子點，尺寸為1 30nm以內，表面電荷性質為正電荷。優選加入CcKe/ZnS水溶性量子點后，再加入PEG-4000至質量濃度為20%。
上述Cdk/ZnS水溶性量子點在以納米基因載體建立高效的植物細胞轉基因體系中的應用。本發明研究了鵝掌楸懸浮細胞和Cdk/ZnS量子點之間相互作用過程以及分析了 CdSe/ZnS量子點的細胞毒性，通過調控Cdk/ZnS量子點的表面電荷、培養時間和培養溫度等條件，系統地探討了兩者之間的相互作用機理(1)納米顆粒主要通過植物細胞膜的液相胞吞作用進入其細胞內部，尺寸合適的外源物質進入植物細胞的困難并非細胞壁本身， 而在于細胞膜；(2) PEG介導作用可以增加植物細胞的攝入納米顆粒的能力；(3)相對于 (-)CdSe/ZnS量子點，(+ ) CdSe/ZnS量子點作為鵝掌楸細胞的納米基因載體更具有優勢， 共孵育時間廣證以內為宜。因此，適用于植物細胞的量子點材料應該具備尺寸大小應該控制在30nm以內(植物細胞壁空隙在2(T40nm)；表面電荷性質應避免為負電荷，降低其自身的細胞毒性；還可以進一步通過生物偶聯技術固定靶分子和細胞膜中相應的受體相互締合，誘導細胞高效攝入；同時可以利用PEG等化學試劑增加細胞膜通透性，增加細胞攝入納米顆粒的能力。此外，還可以利用超聲、電刺激等物理手段來達到同一目的。有益效果與現有技術相比，本發明的顯著優點是本發明采用不同條件對雜交鵝掌楸的胚性懸浮細胞與經不同表面化學修飾的Cdk/ZnS納米顆粒之間進行共孵育，結果表明，在共孵育后池以內，激光共聚焦顯微鏡和電子掃描顯微鏡下，均可在細胞內部的表面觀察到經表面后修飾帶正電荷的Cdk/ZnS納米顆粒，胞吞進入細胞內部的表面攜帶正電荷的Cdk/ZnS納米顆粒的量明顯與共培養時間、溫度有明顯的依賴關系，表明它們可以通過細胞的液相胞吞作用進入雜交鵝掌楸細胞內，且不影響細胞的活性，而表面帶負電荷的Cdk/ZnS納米顆粒則主要聚集在細胞外壁附近，在培養溶液中添加質量濃度比為20% 聚乙二醇，可進一步提高鵝掌楸細胞胞吞Cdk/ZnS納米顆粒的量和減輕Cdk/ZnS納米顆粒的細胞毒性。因此以表面攜帶正電荷的Cdk/ZnS量子點納米材料作為基因載體，在植物懸浮細胞的轉基因研究和應用中具有廣泛的前景，能夠為植物基因工程提供新型的無機納米基因載體和轉基因技術體系。


圖1是鵝掌楸細胞和(士)CdSe/ZnS量子點共孵育9h后典型的激光共聚焦顯微鏡圖片。圖中，(A) ( + )CcKe/ZnS :(a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(B) (-)CdSe/ ZnS (a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(C)大范圍下的(+ ) Cdk/ZnS (a)熒光， (b)明場，(c)明場/熒光重疊；(D) (-) CdSe/ZnS (a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；
圖2是(士)Cdk/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育的不同時間階段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片。圖中，(A) ( + )CcKe/ZnS，3h :(a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(B) (+ ) CdSe/ZnS, 9h (a)熒光，(b)明場，(c)明場 / 熒光重疊；(C) ( + ) CdSe/ZnS, 24h (a) 熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(D) (-) CdSe/ZnS, 3h (a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(E) (_)CcKe/ZnS，9h :(a)熒光；(b)明場；(c)明場/熒光重疊；(F)(-) CdSe/ZnS, 24h (a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊;
圖3 ( + ) CdSe/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育池后電子SEM圖片； 圖4是(+ ) CdSe/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育池后能量譜分析圖；圖5是PEG介導(士)Cdk/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育的不同時間階段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片；圖中，(A) (a) ( + )Cc^e/ZnS，3h:①熒光，②明場，③明場/熒光重疊；(b) ( + )CcKe/ZnS，9h ①熒光，②明場，③明場/熒光重疊；(c) (l)CdSe/ZnS,3h 熒光，②明場，③明場/熒光重疊；(d) (-) CdSe/ZnS, 9h ①熒光，②明場，③明場/熒光重疊；(B)細胞的平均熒光強度和共孵育時間關系柱狀圖6是PEG介導(士)Cdk/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育的不同時間階段典型的平均熒光強度統計結果圖7是(士)Cdk/ZnS量子點細胞毒性FDA染色圖；圖中，(A) (a) ( + ) CdSe/ZnS, 3h, (b) (-) CdSe/ZnS，3h，(c) ( + ) CdSe/ZnS, 9h, (d) (-) CdSe/ZnS，9h，(e) PEG 介導下(+ ) CdSe/ZnS, 9h, (f) PEG 介導下(-)CdSe/SiS，9h，(g)和(h)為空白樣品，即未與 CcKe/ZnS 納米顆粒作用的鵝掌楸細胞；
圖8是在4°C ( + )CdSe/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共孵育的不同時間段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片；圖中，(A)汕(a)熒光，(b)明場，(c)明場/熒光重疊；(B) 9h (a)熒光， (b)明場，(c)明場/熒光重疊。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例所用到的藥品和設備具體如下
Cdk/ZnS水溶性量子點(W1-585，珈源量子點技術開發有限公司，武漢，中國)、熒光素二乙酸酯(FDA) (F0M0，東京化成工業株式會社，日本)、聚乙二醇(PEG-4000，分析純，光華化學試劑公司，中國)、去離子水(電阻率高于18ΜΩ · cm)、其他試劑均為分析純。激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SL, Heidelberg, Germany)、離心機(Eppendorf Centrifuge-5418, Hamburg, Germany)、Milli-Q 超純水終端系統(Millipore SYNS-000CN, USA)、微量移液槍 (Pipet-one, Rainin, USA)、搖床(培英-TCYQ，中國)。實施例1
雜交鵝掌揪(Liriodendron chinense (Hemsl. )Sarg. X L. tulipifera Linn.)的胚性懸浮細胞的培養體系按照現有方法(陳志、陳金慧、邊黎明等，雜交鵝掌楸胚性細胞懸浮系的建立，分子植物育種，2007，5 :1137 - 1140 ；專利申請20101(^98850. 6)建立。使用時， 取ImL鵝掌楸單細胞懸浮液，濃度為1. 5 X IO5個/mL，放置于1. 5mL Eppendorf離心管中， 接著加入10 μ LCdSe/ZnS水溶性量子點，濃度為4 μ mol/L,激發波長為455士 lOnm，熒光最大發射波長585士 lOnm。然后在23°C下，轉速為90r/min的搖床上進行共培養。培養結束后，放入Eppendorf離心機中以2000r/m離心8min，棄上清。再利用細胞培養液清洗3次， 以洗去未被細胞內吞的Cdk/ZnS量子點，制得細胞樣品。在制備細胞樣品中，各參數可以適當調整，以不超過以下參數范圍為宜鵝掌楸單細胞懸浮液濃度為廣5 X IO5個/mL，體積為1 IOmL ；CdSe/ZnS水溶性量子點濃度為1 6ymol/L，體積為 10 50 μ L ；溫度 20 37°C，50 100r/min，搖床培養 3 9h ；2000 4000r/m 離心5 lOmin。本實施例所用( + )CdSe/ZnS量子點為商用的氨基修飾Cdk/ZnS量子點，大小約為 20nm,表面電荷約為+15mV，而相應的(-)CdSe/ZnS量子點為同樣商用的羧基修飾CcKe/ZnS量子點，大小約為20nm，表面電荷為-40mV -30mV。二者除了在表面電荷有差異外，其他性質(包括大小、構成組分及熒光性質)都相同。實驗中，將攜帶正負電荷的Cdk/ZnS量子點分別在相同條件下和雜交鵝掌楸單細胞懸浮液共培養9h后，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，將處理完的樣品滴加到載玻片，再蓋上蓋玻片，以便于激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長為455nm，熒光波長為585nm，并通過激光共聚焦顯微鏡自帶的圖片分析LAS AF Lite 軟件，Version :2. 2.0 build 4785，統計分析50個細胞內部的熒光強度，取平均值，結果如圖1所示，結果表明，雜交鵝掌楸單細胞懸浮液和( + )Cc^e/ZnS量子點共培養后，細胞內部出現明顯的熒光，如圖1中(A) (a)和(C)。該結果顯示，( + XMk/ZnS量子點可以被鵝掌楸細胞攝入到體內，且在胞內分布均勻。而在同樣共培養條件下，(-XMk/ZnS量子點發生團聚后附著在鵝掌楸細胞壁或細胞膜附近(紅線方框中的成團熒光顯示)，如圖1中(B) (C)。 上述差異現象存在于大量細胞中，而非實驗中的個別現象，如圖1 (C) (D)0實施例2
進一步分析鵝掌楸細胞攝入(士)Cdk/ZnS量子點的動力學過程，從實施例1制得的細胞樣品中，取100 μ L分裝于1.5mL Eppendorf離心管中，接著加入去離子水至lmL，加入 FDA染料，濃度為100μ g/mL，激發波長為488 士 lOnm，熒光最大發射波長530 士 lOnm，避光靜置lOmin，離心8min，1000r/m,反復3次，得到濃縮的細胞樣品，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，激發波長為488nm，熒光波長為530nm，同樣通過LAS AF Lite軟件定量分析50個細胞內部的熒光強度，取平均值。結果如圖2所示。由圖2可見，隨著時間延長，導入細胞內部的( + )CdSe/ZnS量子點數量都有所增加，且( + )CdSe/ZnS量子點在細胞內一直分布均勻， 比較圖2 (A) (a), (B) (a)和(C) (a)。對于(_) CcKe/ZnS量子點而言，在3h內，主要團聚在細胞壁外，隨著時間延長，在細胞內部也發現了團聚的量子點，比較圖2 (D) (a), (E) (a)和(F) (a)。實施例3
本實施例同時利用SEM，觀察與( + )CdSe/ZnS量子點共孵育池后的鵝掌楸細胞內部特征。利用適量4%戊二醛，pH7. 2,0. 2mol/L磷酸緩沖液溶液(PBS)，立即固定實施例1制得的細胞樣品4h，pH7. 2,0. lmol/L PBS溶液清洗3次。乙醇梯度脫水2次(30%，15min ；50%, 15min ；70%, 15min ；90%, 15min ； 100%, 15min), 15min醋酸異戊酯置換2次，取出樣品放入干燥籃，進行(X)2臨界點干燥，接著15mA噴金處理90s，最后用于掃描電子顯微鏡(SEM)觀察， 結果如圖3所示。通過對細胞內部表面進行EDS分析發現，在細胞內部含有Zn，S, Cd等元素，如圖4中的紅色圓圈標注，這進一步證明Cdk/ZnS量子點可以穿越鵝掌楸細胞壁和細胞膜，進入細胞內部。實施例4
PEG可以導致植物細胞高度脫水，引起原生質體皺縮、扭曲變形，在細胞膜表面形成可逆性小孔。由于細胞膜通透性增加，外源物質可以經細胞膜上的小孔進入細胞內部。利用激光共聚焦顯微鏡，進一步研究質量濃度比為20%PEG對鵝掌楸細胞和Cdk/ZnS量子點相互作用的影響，方法同實施例1，在加入CcKe/ZnS水溶性量子點后，加入PEG-4000至質量濃度比為20%。結果如圖5和圖6所示，PEG可以有效提高鵝掌楸細胞攝入Cdk/ZnS量子點的能力，尤其可以顯著增加對(_) CdSe/ZnS的攝入量。實施例5(士)CdSe/ZnS量子點作為納米基因載體，其自身的細胞毒性是必須考慮的。已有的動物細胞實驗表明，CdSe/ZnS量子點具有一定的細胞毒性，所以本實驗采用FDA染色法，方法同實施例2，系統分析(士)Cdk/ZnS量子點對鵝掌楸細胞造成的生理毒性，類似實驗尚未見報道。FDA本身無熒光、無極性，但通過細胞膜后，將會受到酯酶分解而產生具有熒光性質的熒光素，它不能自由出入細胞膜。因此有活力的細胞能產生熒光，同時也可以利用其熒光強度定量分析細胞的活力。結果顯示，依據與空白樣品分析結果，鵝掌楸細胞在與( + )CdSe/ ZnS量子點共培養池之后，仍具有很好的活力，如圖7 (A) (a)所示，而和(-)CdSe/ZnS量子點共培養池后，鵝掌楸細胞活力已受到抑制，如圖7 (A) (b)所示。而在9h后，無論(+ ) Cdk/ZnS或(-)Cc^e/ZnS樣品中都出現了明顯的細胞死亡現象。類似的情況同樣發生在 PEG介導實驗中，所以相對于(-)Cc^e/ZnS量子點，( + )Cc^e/ZnS量子點更有可能成為鵝掌楸細胞的納米基因載體，但需要控制在較短的共孵育時間(廣5h以內)。實施例6
對于植物細胞攝入納米顆粒的機理一直存在爭議，Exteberria等人認為，假挪威槭 (Acer pseudoplatanus)原生質體可以通過細胞液相內吞作用攝入量子點；Liu等人也報道了完整的煙草細胞(Nicotiana tabacum)可以通過細胞液相內吞作用攝入碳納米管；最近，Serag等人提出了碳納米管主要是通過刺入長春花(Catharanthus roseus)原生質體的細胞膜機理，進入其內部。為了進一步探索鵝掌楸細胞攝入Cdk/ZnS量子點的相關機理，在4°C下進行( + )CdSe/ZnS量子點和鵝掌楸細胞共培養，實驗結果如圖8所示。對比圖 2中的實驗結果認為，共培養的初期(3h以內)，鵝掌楸細胞主要是依靠液相內吞作用攝入 ( + )CdSe/ZnS量子點，而(-)CdSe/ZnS量子點由于其自身團聚和靜電作用，導致無法被細胞通過液相內吞攝入。在4°C，鵝掌楸細胞沒有攝入( + )CdSe/ZnS量子點，這主要是由于低溫可以抑制細胞的液相胞吞作用。隨著時間延長到9h后，鵝掌楸細胞的細胞膜喪失完整性， (士)Cdk/ZnS量子點可以通過濃度擴散進入細胞內部，而不再依靠細胞的液相內吞作用， 這也導致了無論在4或23°C，(士)Cdk/ZnS量子點都可以進入細胞內部。總之，植物細胞攝入納米顆粒機理相當復雜，其過程是多種作用相互協同發生的。同時，盡管植物細胞壁是大分子物質胞間運輸的主要屏障，但尺寸合適的外源物質進入植物細胞的困難并不是由于細胞壁造成的，而是在于細胞膜。所以提高外源物質導入植物細胞內部的效率，可以利用 PEG介導，增加植物細胞膜的通透性來實現。實施例7
上述實施例1至實施例6，可知量子點材料CcKe/ZnS量子點，尺寸為30nm以內，表面電荷性質為正電荷，可以在以納米基因載體建立高效的植物細胞轉基因體系中的應用。適用于植物細胞的量子點材料應該具備尺寸大小應該控制在30nm以內(植物細胞壁空隙在2(T40nm);表面電荷性質應避免為負電荷，降低其自身的細胞毒性；還可以進一步通過生物偶聯技術固定靶分子和細胞膜中相應的受體相互締合，誘導細胞高效攝入；同時可以利用PEG等化學試劑增加細胞膜通透性，增加細胞攝入納米顆粒的能力。此外，還可以利用超聲、電刺激等物理手段來達到同一目的。
權利要求
1.一種Cdk/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法，其特征在于取1 IOmL濃度為廣5X IO5個/mL鵝掌楸單細胞懸浮液，放置于離心管中，加入10 50 μ L濃度為 1 ~ 6ymol/L的CdSe/ZnS水溶性量子點，控溫20 37 °C，5(Tl00r/min，搖床培養3 9h ； 200(T4000r/m離心5 lOmin，棄上清，用細胞培養液洗去未被細胞內吞的Cdk/ZnS量子點， 即可。
2.根據權利要求1所述的Cdk/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法，其特征在于所述的CcKe/ZnS量子點，尺寸為1 30nm以內，表面電荷性質為正電荷。
3.權利要求2所述的Cdk/ZnS量子點在以納米基因載體建立高效的植物細胞轉基因體系中的應用。
4.根據權利要求1所述的Cdk/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法，其特征在于加入CcKe/ZnS水溶性量子點后，再加入PEG-4000至質量濃度為20%。
全文摘要
本發明公開了一種CdSe/ZnS量子點與植物細胞的共孵育方法，所述的量子點材料為CdSe/ZnS量子點，尺寸為30nm以內，表面電荷性質為正電荷。該植物細胞的量子點材料在以納米基因載體建立高效的植物細胞轉基因體系中的應用。本發明以CdSe/ZnS量子點與雜交鵝掌楸的胚性懸浮細胞采用不同的條件進行共孵育，結果表明胞吞進入完整細胞內部的表面攜帶正電荷的CdSe/ZnS納米顆粒的量明顯與共培養時間、溫度有明顯的依賴關系，它們可以通過細胞的液相胞吞作用進入雜交鵝掌楸細胞內，且不影響細胞的活性；因此以表面攜帶正電荷的CdSe/ZnS量子點納米材料作為基因載體，在植物懸浮細胞的轉基因研究和應用中具有廣泛的前景，能夠為植物基因工程提供新型的無機納米基因載體和轉基因技術體系。
文檔編號C12N15/82GK102250944SQ20111014662
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月2日 優先權日2011年6月2日
發明者夏兵, 施季森, 董琛, 陳金慧 申請人:南京林業大學