專利名稱：一種產富馬酸根霉菌的發酵過程調控方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，涉及一種產富馬酸根霉菌的發酵過程調控方法，具體涉及一種基于代謝組學技術調控根霉菌生物合成富馬酸的方法。
背景技術：
富馬酸是一種含有雙鍵的二元羧酸，可以通過氨化、水合、加氫及異構等工藝生產 L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、馬來酸等化合物，同時，作為重要的有機化工原料和精細化工產品也被廣泛應用于材料(樹脂、涂料及增塑劑等)、醫藥、化工、食品及飼料添加劑等領域(李學坤，張昆，高振等.富馬酸的合成及應用[J].現代化工，2005， 25(suppll): 81-84.)。目前，富馬酸主要通過石油衍生物馬來酸酐轉化而來，然而，隨著石油資源的枯竭和價格的不斷上升，研究者越來越重視用發酵技術代替石油化工轉化技術從可再生資源中生物煉制富馬酸。諸如米根霉(脅辦印狀oryzae)等根霉屬絲狀真菌，其發酵產物可提取富馬酸， 是目前生物法合成富馬酸的主要菌種。但由于根霉菌的重組基因不易表達，特異性重組頻率低，利用基因工程手段來提高根霉菌生產富馬酸的轉化率和生產能力仍很困難。傳統的誘變方法是提高根霉菌發酵富馬酸生產能力的重要工具。但是，由于傳統的誘變方法對細胞是全局性的改變，很難通過定點分析的方法全面深入理解高產富馬酸根霉菌菌株的代謝特征以及根霉菌高產富馬酸的機理，不能有效的指導進一步菌種改造和工業發酵過程的優化。根霉菌胞液中的TCA還原途徑是積累富馬酸的主要途徑，在富馬酸有氧條件下的積累過程中，TCA循環和TCA還原途徑是同時起作用的。TCA循環為細胞提供生長及基礎代謝所需的中間代謝產物與能量ATP，還為TCA還原途徑提供必需的還原力NADH。(Kenealy W, Zaady E, Dupreez JC, et al, Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus . Appl Environ Microbiol, 1986, 52: 128-133.)上述兩條富馬酸代謝途徑間通過能量及還原力相互偶聯。相對以上較多的研究根霉菌生物合成富馬酸的生理過程，卻少有報道根霉菌生物合成富馬酸的分子機理。代謝組是細胞內各種各樣生理變化產生的終端代謝物的集合，被認為是對基因或環境變化響應的一種放大。隨著越來越多的絲狀真菌被測序，科學家需要將這些數據與轉錄信息和代謝輪廓分析信息結合起來以全面系統理解根霉菌胞內代謝組特征(Mei jer，S. ； Panagiotou, G.; Olsson, L.； Nielsen, J. , Physiological characterization of xylose metabolism inAspergillus niger under oxygen-limited conditions. Biotechnology and Bioengineering 2007, 98 (2)，462-475.)，這些信息有利于理解因菌種改造和環境因素變化導致的代謝網絡以及胞內代謝物的響應特性。對根霉菌來說，目前還沒有報道基于代謝組學技術分析基礎上的調控其生物合成富馬酸發酵過程的報道。

發明內容
本發明技術目的是提供一種產富馬酸根霉菌的發酵過程調控方法，該方法能利用代謝組學技術原理，系統、定量測定根霉菌高產富馬酸菌株胞內代謝物，并通過多元統計數據分析方法確定生物標記物和顯著變化的胞內代謝物，并結合根霉菌代謝網絡比較分析獲得根霉菌高產富馬酸的代謝特征，將獲得的信息指導根霉菌生物合成富馬酸發酵過程的調控。為了實現本發明的技術目的，本發明的技術方案如下。—種產富馬酸根霉菌的發酵過程調控方法，其特征在于包括以下步驟 (1)同步培養
將根霉菌的原始菌株和其高產突變株用同樣的培養條件分別同步培養發酵富馬酸，并每12 16 h對發酵液進行取樣。以米根霉為例，在本發明中，具體培養條件為在400 rpm、溫度35°C的NBS發酵罐中，以10%的接種量接入裝液量為5 L的7 L發酵罐中，發酵周期為72 h，每12 1 對發酵液進行取樣分析。(2)根霉菌胞內代謝物的提取
將取樣得到的發酵液中的根霉菌細胞用冷甲醇溶液滅活，并將淬滅后的根霉菌細胞在液氮中搗碎；將甲醇、氯仿、水的預冷溶液加入到細胞粉末中，同時，加入核糖醇作為內標物，振蕩混均。(3) GC-TOF-MS測定和胞內代謝物分析
將步驟(2)得到的樣品分別加入甲氧基銨鹽酸鹽的吡啶溶液和三甲基硅烷基三氟乙酰 (MSTFA)后，用氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF-MS)分析，定性定量檢測出根霉菌細胞內所有代謝物。以米根霉為例，在本發明中，具體的分析方法為i yL的樣品的以分流比1:1比例注入氣相色譜里；質譜的掃描范圍為m/z50-800，分析軟件為Masslynx (version4. 1， Waters);GC-MS的分析峰利用NIST MS數據庫及Golm Metabolome數據庫進行分析確定。(4)多元統計分析
利用主成分分析法(PCA)對步驟(3)確定的胞內代謝物進行分析，確定生物標記物和顯著變化因素。(5)高產富馬酸根霉菌突變株的機理分析
將步驟(4)分析得到的生物標記物和顯著變化因素結合根霉菌的代謝功能區進行比對，分析高產富馬酸突變株細胞內的代謝特征，從代謝水平理解突變株高產富馬酸的機理。其中所述的比對并不局限于糖代謝、氮代謝、嘌呤嘧啶代謝以及脂肪酸代謝等中心碳代謝網絡，也包括質譜檢測出來的其它任何相關代謝功能區。(6)根霉菌生物合成富馬酸的發酵調控
結合根霉菌高產突變菌株的胞內代謝特征，通過有針對性的改變發酵過程參數，以實現調控根霉菌生物合成富馬酸的發酵過程。其中，所述的發酵過程參數主要包括溶氧、pH、轉速等；培養基成分，如碳源、氮源，無機鹽等；培養方式，如分步發酵、連續發酵、補料發酵等；以及外源添加輔助因子等發酵技術以實現強化高產菌株的胞內代謝特征。本發明所述的根霉菌包括米根霉或者少根根霉。本發明的有益效果在于本發明將代謝組學技術應用于指導調控根霉菌生物合成富馬酸的發酵過程。通過對高產富馬酸菌株的代謝組分析，全面獲得根霉菌高產富馬酸胞內代謝特征信息，從而為發酵過程控制優化提供重要指導。與其它發酵調控策略相比，該方法能對細胞所有代謝物進行無偏分析，對發酵調控更具有針對性，效率更高，可以為發酵過程控制優化提供一種高效、系統的方法。


圖1是本發明所述的調控方法示意圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步說明。實施例1
本實施例說明產富馬酸米根霉(脅辦印狀oryzae)的發酵過程調控方法。菌株(1)原始菌株米根霉(ATCC 20344)。(2)高產富馬酸突變菌株采用波長為800 nm、重復頻率為76 MHz的飛秒激光， 在照射功率為5 40 mW、照射時間為5 30 s的條件下對上述原始菌株進行處理，獲得了一株米根霉高產富馬酸菌株；其中所用的優化飛秒激光誘變方法，來自專利
發明者于守智, 徐晴, 李霜, 聞建平, 黃和 申請人:南京工業大學, 天津大學