專利名稱：一種穩定表達山羊miR-103的腺病毒載體的構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種載體構建方法，具體而言涉及一種穩定表達山羊miR-103的腺病毒載體的構建方法及其應用。
背景技術：
MiRNA的成熟經歷了 miRNA、pre-miRNA和pri-miRNA miRNA三種形式，三種形式均可構建其的表達載體，但是具有莖環結構的pre-miRNA比miRNA更穩定，pre-miRNA兩側的序列參與其的加工和成熟。另外，腺病毒載體具有轉染效率高、感染細胞范圍廣、病毒滴度高等優點，可感染處于細胞周期中的靜止期和分裂期細胞。構建重組腺病毒載體并在 293細胞中包裝成熟病毒顆粒是應用腺病毒作為媒介表達目標基因的前提。綠色熒光蛋白 (GFP)是試驗中廣泛應用的一種蛋白指示劑，可作為觀察測定病毒感染和外源基因表達水平。本研究選用的腺病毒系統是以Ad5血清型E1 /E3缺陷型腺病毒DNA為骨架， 穿梭載體PAdTrack-CMV攜帶有報告基因綠色熒光蛋白GFP，較易進行觀察。首先克隆 pri-miR-103,并構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-pri-miR-103，然后將穿梭載體與腺病毒骨架pAdEasy-Ι載體在大腸桿菌BJ5183 (重組酶缺陷型大腸桿菌)中同源重組，獲得穩定表達miR-103的重組腺病毒載體Ad-pri-miR-103，為進一步在細胞水平上研究miR-103對乳腺脂肪酸代謝的調控作用提供試驗材料。過表達miR-103，可能引起乳腺脂肪酸代謝相關基因的表達量變化，進而改變脂肪酸的組成及含量，為提高山羊乳及其產品的營養價值提供一個新的切入點。

發明內容
為了構建腺病毒載體，本發明采用如下的技術方案本發明一方面涉及一種山羊miR-103的腺病毒載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟合成上、下游引物，以山羊miR-103DNA模板進行PCR擴增，其中所述上游引物為 5’ -CGC GATCGGTACCAA CAGAACATTTTGAG,下游引物 5，-CACGTGGGCTAAGCTTG CATATACAC CTACTACAT (下劃線部分為酶切位點)；將pri-miR-103擴增產物與pAdTrack_CMV穿梭質粒同時進行Kpn I/Hind III雙酶切；加入連接酶進行連接反應。在本發明的一個優選實施方式中，PCR擴增的循環為20-50，優選為30_40。在本發明的一個優選實施方式中，PCR擴增之后包括采用的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收產物的步驟。在本發明的一個優選實施方式中，其特征包括對病毒載體進行酶切線性化，優選用Riie I酶切線性化。本發明還涉及采用上述方法構建得到的腺病毒載體。本發明另外一方面還涉及所構建的腺病毒載體在基因重組中的應用。
在本發明的一個優選實施方式中，其特征在于將PAdEasy-I病毒骨架先轉化入大腸桿菌，再用線性化的載體進行同源重組。將克隆pri-miR-103-l(pre-miR-103及側翼序列)至病毒的穿梭載體，保證了 pre-miR-103的加工和成熟，增加了 miR-103表達的穩定性。另外，將pAdEasy-Ι病毒骨架先轉化入大腸桿菌BJ5183，再用線性化的穿梭載體pAdTrack-CMV-pri-miR-103轉化BJ5183 進行同源重組，降低了假陽性的比例，提高了重組效率。


圖1. pri-miR-103的PCR擴增產物凝膠電泳結果；圖2.連接酶連接后質粒經Kpn I和Hind III酶切產物凝膠電泳結果，片段較小的電泳產物為 pri-miR-103-l，長 300bp ；圖3.重組腺病毒pAd-pri-miR-103-l的凝膠電泳結果。
具體實施例方式1. 1. 1 山羊 pri-miR-103 的克隆上、下游引物分別引入Kpnl和Hind III酶切位點，以山羊pri_miR-103DNA模板進行 PCR 反應:94°C,3min ；94°C，20s ；60°C, 30s ；72°C，30s ；34 個循環；72°C，5min。的瓊
脂糖凝膠電泳檢測并回收產物。產物送測序。
權利要求
1.一種山羊miR-103的腺病毒載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟合成上、 下游引物，以山羊DNA模板進行PCR擴增，其中所述上游引物為5，-CGC GATCGGTACCAA CAGAACATTTTGAG,下游引物 5，-CACGTGGGCTAAGCTTGCATATACAC CTACTACAT ；將 pri-miR-103 擴增產物與pAdTrack-CMV穿梭質粒同時進行Kpn I/Hind III雙酶切；加入連接酶進行連接反應。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于PCR擴增的循環為20-50，優選為 30-40。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，PCR擴增之后包括采用的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收產物的步驟。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征包括對病毒載體進行酶切線性化，優選用 Pme I酶切線性化。
5.權利要求1-4任意一項所述的方法構建得到的腺病毒載體。
6.權利要求5所述的腺病毒載體在基因重組中的應用。
7.權利要求6所述的應用，其特征在于將pAdEasy-Ι病毒骨架先轉化入大腸桿菌，再用線性化的載體進行同源重組。
全文摘要
本發明公開了一種山羊miR-103的腺病毒載體的構建方法及其應用，其特征在于包括如下步驟合成上、下游引物，以山羊miR-103DNA模板進行PCR擴增，其中所述上游引物為5’-CGC GATCGGTACCAACAGAACATTTTGAG，下游引物5’-CACGTGGGCTAAGCTTG CATATACAC CTACTACAT；將pri-miR-103擴增產物與pAdTrack-CMV穿梭質粒同時進行Kpn I/HindⅢ雙酶切；加入連接酶進行連接反應。該方法增加了miR-103表達的穩定性，再同源重組時能夠降低了假陽性的比例，提高了重組效率。
文檔編號C12N15/66GK102286516SQ201110207230
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月25日 優先權日2011年7月25日
發明者余康, 張犁蘋, 朱江江, 林先滋, 羅軍, 趙旺生 申請人:西北農林科技大學