一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法。本發明人通過改進構建方法，構建了一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體。所述的疫苗載體可應用于制備可高效表達且具有良好免疫原性的疫苗。
【專利說明】一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和病毒學領域；更具體地，本發明涉及一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]腺病毒(Adenovirus)是一種無包膜、線性化的雙鏈DNA病毒，能夠高效感染各種哺乳動物細胞且易于擴增及純化，被作為基因載體工具廣泛用于分子和細胞生物學研究。腺病毒能在體內有效地誘導強烈的體液免疫和細胞免疫反應，被認為是目前最有應用前景的疫苗載體之一，包括用于研發HPV、HIV，乙肝、丙肝、流感、瘧疾、狂犬病等疾病的疫苗。傳統的腺病毒載體主要是基于人血清型AdHu2和AdHu5，其中AdHu5曾一度被應用于臨床基因治療。然而據血清型調查表明人群中約40-60%的個體中含有抗人血清型腺病毒的中和抗體，導致基于人血清型腺病毒載體的免疫效果受到體內預存的中和抗體很大程度的影口向(Singh, N.等，Molecular therapy: the journal of the American Society of GeneTherapyl6,965-971, do1: 10.1038/mt.2008.12(2008) ；Sprangers, M.C.等，Journal ofclinical microbiology41,5046-5052(2003))。
[0003]目前腺病毒載體的構建策略一般采用同源重組的方法，包括:(1)細胞內同源重組，此方法缺點是易受到親代腺病毒的污染，必須經過2-3次的病毒空斑純化，并通過多次的噬斑形成方法鑒定重組病毒；另外重組效率低下，產生重組的時間至少需要兩周以上。
(2)位點特異性重組，缺點是同樣易受親代病毒的污染，需要經過多次病毒空斑純化，由于引入了 Cre/loxp重組系統，會增加腺病毒發生遺傳改變的幾率，獲得不穩定的腺病毒子代。(3)細菌內同源重組(如AdEasy? System)，其缺點是篩選陽性克隆比較繁瑣，同時由于引入同源重組方法，腺病毒基因組在大腸桿菌中易發生突變。
[0004]因此，本領域技術人員還需要開發新的構建腺病毒載體的方法，以及開發免疫效果理想的腺病毒。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種基于腺病毒AdC68的表達載體及其構建方法。
[0006]在本發明的第一方面，提供一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列；所述的連接序列中，設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce
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[0007]在一個優選例中，所述的4個片段分別是:
[0008]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位；
[0009]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位；
[0010]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和
[0011]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。[0012]在另一優選例中，各片段的氨基酸位點計算基于GenBank登錄號AC_000011的核苷酸序列。
[0013]在另一優選例中，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點切除腺病毒El的大部份編碼序列，大小約為3.5kb，將其替換為含有內切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。
[0014]在另一優選例中，所述的骨架載體是pNEB193載體。
[0015]在另一優選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本發明的另一方面，提供一種腺病毒表達載體，所述表達載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列(Linker)替換；所述的連接序列中設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0017]在另一優選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0018]在另一優選例中，所述的腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0019]在另一優選例中，所述表達載體的酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I之間，還包括外源的抗原編碼基因。
[0020]在另一優選例中，所述的外源的抗原是(但不限于)腸道病毒EV71的VPl抗原。
[0021]在另一優選例中，所述的VPl抗原的編碼基因的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0022]在本發明的另一方面，提供一種制備疫苗的方法，所述方法包括:
[0023](I)提供所述的腺病毒表達載體；
[0024](2)將外源的抗原編碼基因插入到(I)表達載體的酶切位點1-Ceu I和P1-SceI之間；
[0025](3)將(2)的重組表達載體感染病毒生產細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的疫苗。
[0026]在本發明的另一方面，提供一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括:前面任一所述的腺病毒表達載體。
[0027]在另一優選例中，所述試劑盒還包括:病毒生產細胞；和/或抗原編碼基因。
[0028]在另一優選例中，所述的病毒生產細胞是HEK293細胞。
[0029]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1、野生型腺病毒AdC68基因組的酶切鑒定結果。
[0031]M =DNA分子量標準;1、2:Bgl II和Mfe I酶切鑒定。
[0032]圖2、復制缺陷型腺病毒載體AdC68的構建及鑒定。
[0033]A、基于腺病毒AdC68基因組酶切位點分析的結果，將其分成KE，AK, XA和PX四個片段，在其末端分別添加Pac I酶切位點便于線性化。
[0034]B、構建復制缺陷型腺病毒AdC68的策略示意圖:先將KE，AK，XA組裝入pNEB193載體；將另一部分的PX組裝入另一個PNEB193載體，其中在PX部位刪除腺病毒El部分區域并連入含有1-Ceu I和P1-Sce I歸位內切酶的Linker ;最后組裝成完整的El部分刪除的復制缺陷型腺病毒AdC68。
[0035]C、復制缺陷型腺病毒AdC68的酶切鑒定結果。M:DNA分子量標準；l_4:Xho I，Bgl II，Mfe I和Xma I分別酶切鑒定結果。
[0036]圖3、含有報告基因的重組載體pAdC68-El-deleted+EGFP(即pNEB193+El-deleted AdC68_EGFP)構建及鑒定結果。
[0037]A、報告基因CMV-EGFP克隆入pAdC68-El_deleted載體示意圖。
[0038]B、質粒 pAdC68-El-deleted+EGFP 的酶切鑒定結果。M =DNA 分子量標準；1_4 =XhoI，Bgl II，Mfe I和Xma I分別酶切鑒定結果。
[0039]圖4、轉染含有報告基因的重組載體pAdC68-El-deleted+EGFP的熒光表達情況(100X)。
[0040]圖5、第 12 代重組腺病毒 AdC68-El-deleted 和 AdC68-El-deleted+EGFP 基因組的鑒定。
[0041]A、重組腺病毒AdC68-El_deleted基因組的酶切鑒定結果；M:DNA分子量標準；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結果。
[0042]B、重組腺病毒AdC68-El_deleted+EGFP基因組的酶切鑒定結果；M:DNA分子量標準；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結果。
[0043]圖6、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的酶切鑒定。
[0044]A、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl質粒的酶切鑒定結果；M:DNA相對分子質量標準；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結果。
[0045]B、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl基因組的酶切鑒定結果；M:DNA相對分子質量標準；1_3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結果。
[0046]圖7、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的VPl蛋白表達及抗體反應。
[0047]A、ffestern-blot 檢測 VPl 基因的表達。1:陰性對照(AdC68_empty,即AdC68-El-deleted) ;2_5:分別為 108vp、109vp、IOicVp 和 10nvpAdC68-El-deleted+VPl ；6:陽性對照，EV71滅活病毒。
[0048]B、ELISA檢測AdC68-El_deleted+VPl誘導的特異性抗體。圖示各樣本血清稀釋度為1:80的OD值。
【具體實施方式】
[0049]本發明人經過深入的研究，通過改進構建方法，構建了一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體。所述的疫苗載體可應用于制備可高效表達且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0050]為解決現有技術的問題，本發明人選擇稀有血清型或其他種屬來源的腺病毒作為疫苗載體，由于人群中一般不會含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗體，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗載體，其免疫效果將顯著優于以人血清型腺病毒構建的疫苗載體。
[0051] 因此，本發明提供了一種腺病毒表達載體，所述表達載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El編碼序列由連接序列替換；所述的連接序列中設置酶切位點 1-Ceu I 和 P1-Sce I。
[0052]針對腺病毒AdC68基因組，本發明人經過細致的序列比對，最終確定了應用酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I作為外源基因的插入位點，從而不會導致在腺病毒表達載體的其它位置造成剪切。[0053]由于腺病毒的基因組比較大，大約有36kb，使直接克隆重組腺病毒載體成為技術瓶頸。因此，本發明人開發了能通過酶切連接的快速方法直接構建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作為疫苗載體，即充分利用腺病毒基因組中存在的某些酶切位點。根據對腺病毒AdC68整個基因組序列的分析，將其分成KE，AK，XA和PX四個片段，然后通過酶切連接的方法再逐步克隆到PNEB193的載體中，最終獲得一個復制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點刪除了與腺病毒復制相關的El部分，大小約為3.5kb，將其替換為含有歸位內切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。此方法構建的復制缺陷型腺病毒AdC68經過線性化能夠在HEK293細胞中成功包裝并擴增出遺傳穩定的重組腺病毒。
[0054]KE, AK, XA和PX四個片段之間可包括限制性的酶切位點，這樣有利于各元件的有機連接。
[0055]所述的表達載體通常還含有復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子(如CMV)上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。
[0056]本發明還提供了一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El編碼序列；所述的 連接序列中，設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0057]獲得所述腺病毒表達載體后，將之轉染病毒生產細胞，進行病毒的繁殖。轉染后的一段時間后，可以收獲病毒。作為本發明的優選方式，收獲的病毒可反復感染病毒生產細胞，持續傳代。病毒滴度(TCID5tl)的測定可以根據本領域常規方法進行。
[0058]本發明的腺病毒表達載體作為一個表達載體平臺，適用于表達多種抗原，從而制備病毒疫苗。所述的抗原沒有特別的限制。
[0059]作為本發明的優選方式，本發明人通過利用腺病毒基因組直接克隆方法構建成復制缺陷型腺病毒AdC68載體后，將腸道病毒EV71的VPl基因克隆至AdC68載體，免疫小鼠后該重組載體AdC68-VPl能誘導特異性免疫反應，證明本發明人成功獲得一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68的新型疫苗載體，為新型疫苗研發提供一種新型的載體平臺。
[0060]本發明避開了傳統的通過同源重組方法構建腺病毒載體，極大程度上降低了腺病毒發生突變的可能，遺傳穩定性好，通過引入Stbl2大腸桿菌轉化體系，使得腺病毒發生突變的概率進一步降低。因此，利用本發明獲得的腺病毒載體表達外源基因將更穩定、高效。本發明利用體外直接酶切連接方法構建腺病毒載體，在細菌水平篩選獲得陽性克隆更容易、更便捷，極大地縮短了腺病毒載體的構建時間。此外，本發明適用于所有腺病毒載體的構建，僅僅需要對腺病毒基因組酶切位點進行分析并加以合理應用即可，能被普遍推廣應用于所有生物醫學實驗室，還能對腺病毒內部序列進行優化改造，構建各自特異性的腺病毒載體。綜上所述，本發明不僅提供了一種新型表達載體，而且對腺病毒載體的構建提供了一種新的優異方法，將更好地促進腺病毒在生物醫學基礎研究領域和臨床應用開發方面發揮其優異特征，為保障人類健康、提高生活質量奠定基礎。[0061]基于本發明的新改進，本發明還提供了一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括所述的腺病毒表達載體。
[0062]所述的試劑盒還可包括病毒生產細胞，所欲表達的抗原的編碼基因。此外，所述的試劑盒中還可包括說明疫苗制備方法的使用說明書。
[0063]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0064]1.材料
[0065]1.1動物、病毒株和細胞 [0066]雌性BALB/C小鼠(6_8周)購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司；野生型腺病毒 AdC68 (GenBank 登錄號 AC_000011)購于 ATCC(American Type Culture Collection,Manassas, VA) ;HEK293細胞株購自中國科學院上海生物化學和細胞生物研究所，培養液為有10%(v/v)胎牛血清DMEM。
[0067]1.2限制性內切酶、菌種與質粒
[0068]所有限制性內切酶以及pNEB193質粒購自New England Biolabs ；DH5 α和Stbl2菌種購自Invitrogen。
[0069]質粒pShuttle-CMV 購自 Clontech Laboratories, Inc。
[0070]質粒pShuttle-CMV-EGFP構建:EGFP序列(SEQ ID NO: 3)獲自南京金斯瑞公司，并由該公司克隆至PUC57載體，獲pUC57-EGFP。本發明人將pUC57_EGFP中EGFP克隆至pShutt Ie-CMV 載體，獲 pShutt I e-CMV-EGFP。
[0071]pUC57-VPl (optimized):優化的VPl序列(SEQ ID NO:4)由南京金斯瑞公司合成，并克隆至PUC57載體，獲pUC57-VPl。
[0072]2.方法
[0073]2.1擴增病毒和分離病毒基因組
[0074]在一個T175cm培養瓶中培養80-90%密度的HEK293細胞，應用野生型腺病毒AdC68感染細胞，感染24h后收集細胞，在室溫與_80°C超低溫之間反復凍融3次，3500rpm/min低溫離心10min取上清，再次感染20個T175cm培養瓶中長至80-90%的HEK293細胞。待HEK293細胞被病毒完全裂解后收集細胞，同樣反復凍融3次，然后用標準的氯化銫梯度沉降的方法純化腺病毒AdC68。
[0075]根據DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA)試劑盒標準的說明步驟分離純化腺病毒AdC68的基因組，并酶切鑒定。
[0076]2.2復制缺陷型腺病毒AdC68載體的構建
[0077]2.2.1 質粒 pNEB193+KE 的構建
[0078]根據pNEB193載體上的多克隆位點和腺病毒AdC68基因組的序列，設計擴增KE片段的引物(表1)，PCR擴增目的產物KE片段。PCR擴增體系總體積為50uL，反應循環參數為:95°C預變性 5min ;94°C變性 Imin ;退火溫度 57°C 30s ;72°C延伸 2.2min。EcoR I 和 KpnI雙酶切PCR擴增的KE片段，瓊脂糖凝膠純化KE片段，連接至經相同酶切的PNEB193載體，轉化入DH5 α感受態細胞中，挑取陽性克隆，經酶切和測序鑒定得到ρΝΕΒ193+ΚΕ。[0079]表1、PCR引物序列
[0080]
【權利要求】
1.一種制備腺病毒表達載體的方法，其特征在于，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列；所述的連接序列中，設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4個片段分別是: 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.一種腺病毒表達載體，其特征在于，所述表達載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列替換； 所述的連接序列中設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
5.如權利要求4所述 的腺病毒表達載體，其特征在于，所述的連接序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
6.如權利要求5所述的腺病毒表達載體,其特征在于，所述的腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.如權利要求5所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體的酶切位點1-CeuI和P1-Sce I之間，還包括外源的抗原編碼基因。
8.如權利要求7所述的表達載體，其特征在于，所述的外源的抗原是腸道病毒EV71的VPl抗原。
9.一種制備疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供權利要求4所述的腺病毒表達載體； (2)將外源的抗原編碼基因插入到(I)表達載體的酶切位點1-CeuI和P1-SceI之間； (3)將(2)的重組表達載體感染病毒生產細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的疫苗。
10.一種用于制備疫苗的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 權利要求4-8任一所述的腺病毒表達載體。
11.如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括: 病毒生產細胞；和/或 抗原編碼基因。
【文檔編號】A61P31/14GK103937835SQ201310362225
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】周東明, 楊勇, 丁妙 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所