專利名稱：Ibdv無血清微載體懸浮培養增殖的方法
技術領域：
本發明涉及將雞傳染性法氏囊病毒在無血清培養基及微載體的懸浮培養Vero上的增殖，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)，是由傳染性法氏囊病毒 (IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病，最早發生于美國Delaware州的Gamboro地區， 主要感染3飛周齡的青年雞，病毒在法氏囊的淋巴細胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細胞，引起嚴重的免疫抑制。1980年以后該病傳入我國并大面積暴發和持續流行，嚴重影響了我國養雞業的發展，當前對于該病普遍采用接種疫苗的進行預防。目前，國內生產IBDV疫苗大部分采用雞胚培養增殖病毒或有血清培養的雞胚成纖維細胞。在培養基中添加一定量的新鮮血清，常用胎牛血清或小牛血清，因為血清可供給細胞營養成份，血清中的激素可刺激細胞生長，血清中的許多結合蛋白對激素、維生素和脂類等有穩定和調節作用。但是，培養基中含有血清成份，用以制造疫苗可誘發過敏反應，對提純和收獲細胞產物帶來很大困難，加上每批血清的質量不同，從而影響疫苗的穩定性。由血清使用所造成的細胞培養過程和細胞表達產物安全性的不確定因素增加的現實問題，成為動物細胞無血清培養技術研究和應用的發展動因。隨著動物細胞無血清培養技術的不斷進步，為包括Vero細胞在內的動物細胞大規模無血清培養技術的應用提供了必要的技術支撐，無血清培養已成為包括疫苗在內的生物技術藥物生產的總趨勢。2010 年，美國、歐盟和日本等發達國家將全面停止在生物制藥中應用血清，FDA將停止含血清細胞培養工藝生產的生物技術新藥的申報受理。當前，國內普遍使用轉瓶接種IBDV的生產方式，培養體積0. 5L左右，無法進行大規模制備。國外已經使用微載體在生物反應器中培養Vero細胞生產部分病毒性疫苗產品， 國內個別企業通過引進技術已經使用微載體Vero細胞生產疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種IBDV病毒在無血清培養基以及微載體懸浮培養的Vero 細胞上增殖的方法，本發明的另一個目的是篩選出適合IBDV病毒在無血清培養基培養條件下增殖新的培養基成分，適合大批量病毒的制備，并避免了血清中攜帶外源性病毒的危害。本發明的IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法，包括下列步驟
DVero細胞的無血清培養的馴化逐步降低Vero細胞培養基中的血清濃度，在15代之內將血清降低到0. 2% ；將低血清培養的細胞轉到無血清培養基中培養，待細胞適應后， 擴增細胞作為種子庫細胞；
2) IBDV病毒增殖將馴化的細胞接種到含0. 25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基， 待細胞粘附到微載體并開始生長時接種IBDV病毒，90h收獲病毒。
優選地，
所說的步驟2)中IBDV病毒增殖具體包括以下步驟
1)將無血清培養的Vero細胞消化后離心，按照3、XIO5ceIVmL的初始密度重懸到病毒維持液中；病毒維持液成分為含0. 25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基IVT ；細胞初始培養條件為PH值7. 1、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37 °C ；
2)待細胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時的微載體的粘球率達到 40^50% ；病毒接種量病毒以0. 0Γ0. 2的感染復數接種；IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ 值7. 2、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C，接種90h收獲病毒。本發明對從ATCC引進的Vero細胞進行馴化，降血清的培養，最終獲得無血清微載體培養條件下的Vero細胞，同時改進IBDV病毒增殖時培養基成分，減少外源性病毒的影響，提高IBDV在無血清微載體培養條件下的病毒效價。通過優化病毒繁殖培養基增殖的 IBDV病毒效價高于未優化培養基增殖的IBDV和采用雞胚成纖維細胞增殖的IBDV病毒效價；與Vero細胞有血清培養的IBDV相當；免疫原性實驗表明該病毒的免疫原性強，適合作為疫苗生產。


圖1是經馴化的Vero細胞在無血清培養時細胞形態；
圖2是經馴化的Vero細胞在無血清微載體懸浮培養時細胞形態； 圖3是經馴化的Vero細胞在無血清微載體懸浮培養時的具體生長曲線； 圖4是無血清培養Vero細胞微載體懸浮培養增殖IBDV的細胞形態(接毒后Mh、48h、 72h、90h)；
圖5不同培養方式增殖的IBDV效價比較。
具體實施例方式以下敘述本發明的具體實施例，應該說明的是實施例只對本發明有說明作用，而沒有限制作用。本發明使用的無血清培養的Vero細胞由江蘇省農科院國家獸用生物制品研究中心馴化并保存；無血清培養IVT購于Cell Culture "Technologies公司；降血清培養過程中使用的培養基一199購于北京清大天一公司；微載體Cytodex 1購于GE healthcare，將干燥的微載體放入無Ca2+、Mg2+的PBS中浸泡池，之后再用PBS洗滌2次，經121 °C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后置4°C待用，使用前用細胞培養液清洗2次后即可使用；5L細胞培養反應器購于上海國強生物技術有限公司，乳清蛋白水解物購于Sigma公司。實施例1馴化Vero細胞在無血清微載體懸浮培養馴化Vero細胞在無血清微載體懸浮培養包括下列步驟 1、馴化Vero細胞
復蘇Vero細胞，采用序貫適應法適應方法馴化細胞。在細胞適應過程中，以 1 X 105cell/mL細胞濃度傳代。序貫適應法詳細步驟Vero細胞在10% FCS的DMEM中復蘇培養，再依次在5%、洲 、1%、0. 5%FCS的199培養基中傳代，逐步降低血清濃度，最后在15代內將細胞轉到無血清IVT培養，觀察細胞形態，如圖1所示。馴化后的細胞較10%血清培養的Vero細胞形態細長；細胞1分3傳代后，4h后細胞貼壁開始生長；在培養24h后達到生長高峰，72h長滿細胞瓶。穩定培養5代后，將細胞擴大培養，凍存細胞，建立初始細胞庫F0-IVT。,Vero細胞的復蘇與擴大培養
從初始細胞庫中復蘇FO-IVT的Vero細胞，將細胞在方瓶中擴增到一定數量。、Vero細胞在無血清微載體懸浮培養
將無血清培養的Vero細胞用0. 25%的胰酶消化后，重懸于新鮮的IVT培養基中， 1500rpm離心IOmin后，棄上清。將細胞再次重懸在新鮮的IVT培養基中，細胞進行計數，按照按照3、X IO5ceIVmL的初始密度接種到含2g/L的微載體懸液中，進入反應器培養。5L細胞培養反應器中細胞懸浮培養條件pH值7. 1、攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度 37°C。如圖2所示，細胞在他后貼附微載體，并開始生長。每天取樣觀察細胞狀態，并進行細胞計數。細胞在4天后達到最大細胞密度1. 2X106cell/mL,具體生長曲線見圖3。
實施例2 IBDV (雞傳染性法氏囊病毒)在無血清微載體懸浮培養的Vero細胞上增殖
1、初始Vero細胞在無血清微載體懸浮培養
將無血清培養的Vero細胞用0. 25%的胰酶消化后，重懸于新鮮的IVT培養基中， 1500rpm離心IOmin后，棄上清。將細胞按照3、X 105cell/mL的初始密度重懸在病毒維持液中含0. 25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基IVT，進入反應器培養。細胞初始培養條件pH值7. 1、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C ；
2、IBDV病毒的增殖
待細胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時的微載體的粘球率達到 40 50% ；
病毒接種量病毒以0. ΟΓΟ. 2的感染復數接種；
IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ值7. 2、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度 37 °C。接毒后24h取樣觀察，接毒后24h細胞仍處于生長階段，細胞密度可以達到 5、X IO5Cel 1/mL，48h細胞有部分開始從微載體上脫落，72h有50%左右細胞脫落，最終90h 細胞大部分從微載體上，收獲病毒。、IBDV病毒效價的測定
病毒收獲后反復凍融3次，釋放病毒，在制備好的CEF上測定病毒效價，同時測定CEF 增殖的IBDV、10%血清培養的Vero細胞增殖IBDV病毒效價，進行比較。結果顯示無血清微載體懸浮培養的Vero細胞增殖的IBDV病毒效價TCID5tl從Mh IO4 VmL到最終培養90h收獲病毒時的IO7 5AiL ；病毒增殖1000倍。高于未優化培養基增殖的IBDV的IOVmL ；比CEF增殖的IBDV的107/mL高；等同于10%血清培養的Vero細胞增殖IBDV病毒效價(圖5)。、IBDV病毒免疫原性檢測
將病毒制成疫苗后，免疫21日齡雞，免疫疫苗后7、14、21二8天，采血分離血清。采用固定病毒稀釋血清法進行血清中和試驗，檢測血清中抗體效價，當血清稀釋2500倍后仍能中和100 TCID5tl的病毒，不產生病變，認為合格，判為陽性血清。 檢測結果表明自制油苗，在免疫后14天產生20%的陽性率，21J8天陽性率升高到83. 3%,90. 7%，可以肯定由無血清微載體懸浮增殖的IBDV免疫原性較好。
權利要求
1.IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法，其特征在于，包括下列步驟DVero細胞的無血清培養的馴化逐步降低Vero細胞培養基中的血清濃度，在15代之內將血清降低到0. 2% ；將低血清培養的細胞轉到無血清培養基中培養，待細胞適應后， 擴增細胞作為種子庫細胞；2) IBDV病毒增殖將馴化的細胞接種到含0. 25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基， 待細胞粘附到微載體并開始生長時接種IBDV病毒，90h收獲病毒。
2.根據權利要求1所述的IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法，其特征在于，所說的步驟2)中IBDV病毒增殖具體包括以下步驟1)將無血清培養的Vero細胞消化后離心，按照3、XIO5ceIVmL的初始密度重懸到病毒維持液中；病毒維持液成分為含0. 25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基IVT ；細胞初始培養條件為PH值7. 1、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37 °C ；2)待細胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時的微載體的粘球率達到 40^50% ；病毒接種量病毒以0. ΟΓΟ. 2的感染復數接種；IBDV病毒增殖期間，維持條件ρΗ 值7. 2、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37°C，接種90h收獲病毒。
全文摘要
本發明提供了一種IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法，包括下列步驟1)Vero細胞的無血清培養的馴化；2)IBDV病毒增殖將馴化的細胞接種到含0.25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基，待細胞粘附到微載體并開始生長時接種IBDV病毒，90h收獲病毒。本發明對從ATCC引進的Vero細胞進行馴化，降血清的培養，最終獲得無血清微載體培養條件下的Vero細胞，同時改進IBDV病毒增殖時培養基成分，減少外源性病毒的影響，提高IBDV在無血清微載體培養條件下的病毒效價。通過優化病毒繁殖培養基增殖的IBDV病毒效價高于未優化培養基增殖的IBDV和采用雞胚成纖維細胞增殖的IBDV病毒效價；與Vero細胞有血清培養的IBDV相當；免疫原性實驗表明該病毒的免疫原性強，適合作為疫苗生產。
文檔編號C12N7/00GK102268411SQ20111023180
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者侯繼波, 馮磊, 吳培培, 王偉峰 申請人:江蘇省農業科學院