專利名稱：針對煙草黑脛病的生防細菌及用量的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種針對煙草黑脛病的生防細菌及用量的篩選方法，屬于作物病害生物防治技術領域。
背景技術：
隨著社會的發(fā)展，人們對吸煙給身體帶來的危害越來越關注，對煙葉生產(chǎn)過程中化肥和農(nóng)藥的施用量的控制越來越強烈，大量的研究表明，煙草的許多病害可以通過生防細菌來防治；且利用生防細菌防治植物病害是今后發(fā)展的重點方向；生防細菌防治植物病害的一個難點是高效生防細菌的篩選?，F(xiàn)有生防細菌菌株的選取往往通過以下步驟實現(xiàn)的，采用培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)法篩選具有抑菌圈效果的細菌，然后再活體盆栽驗證其防病效果， 這種方法往往工作量大、速度慢、需要大量的試驗材料和勞動量，其周期一般為90天以上， 嚴重制約了生防細菌菌株的選取。同時許多生防細菌在離體平板上對病原菌具有抑制效果，而在活體上卻沒有防治效果；而有一些拮抗細菌在活體上有很好的防治效果，而在離體平板上卻沒有活性，因此采用培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)法篩選拮抗細菌存在許多漏洞，有一定幾率會使好的生防細菌遺失，不利于植物病害生物防治的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種篩選準確率高、工作量小、速度快、成本低的針對煙草黑脛病菌的生物防治細菌及用量的篩選方法，可以克服現(xiàn)有技術的不足。本發(fā)明的技術方案是針對煙草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法包括以下步驟
a、在一組以上的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)無菌煙苗，直至煙苗兩片子葉完全展開；
b、在步驟a的基礎上，向培養(yǎng)皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液進行保護活性篩選；或在a步驟的基礎上，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液進行治療活性篩選；
C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液一起培養(yǎng)M小時后，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液；或待煙苗和煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液一起培養(yǎng)24 小時后，向培養(yǎng)皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液；
d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測添加的具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液的防治效果，選出能夠防治煙草黑脛病的生防菌株。具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
a、從煙草種植大田的煙草染病區(qū)域中選該區(qū)域中無染病煙株的土壤和煙葉；
b、采用細菌傳統(tǒng)NA培養(yǎng)基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態(tài)、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養(yǎng)；
c、b步驟所得單菌落菌株在NB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm。
在每個培養(yǎng)皿中添加的煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液的數(shù)量為ImlX IO5個/ ml ο在得到生防菌株后，將其配成細菌菌懸液，并將濃度分別為10 Cfu-IO9 cfu的細菌菌懸液加入到煙苗培養(yǎng)皿中，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來判斷對最佳的生防菌株和生防細菌的最佳防病濃度。濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌培養(yǎng)液按濃度被分為5-20份添加到煙苗培養(yǎng)皿中，通過防病效果來篩選得到最佳細菌用量。所述的生防細菌為可以為現(xiàn)有已知的化學殺菌劑。在培養(yǎng)皿中鋪設有濾紙
與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明通過在培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上種植無菌煙苗作為生防細菌篩選的活體對象，這樣就可利用活體對象直接對所選取的未知細菌是否具有生防效果進行篩選。同現(xiàn)有篩選方法相比，本法具有以下優(yōu)點1、本篩選方法避免了培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)法篩選，這樣不僅可以節(jié)約大量人力、物力和時間；而且可以避免一些在離體平板上沒有效果，而在活體上有效果菌株的漏選；2、活體篩選在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)周期一般為7天，只需待兩片子葉完全展開即可使用，相對現(xiàn)有的活體盆栽驗證更加省時、省力，節(jié)約空間，且在培養(yǎng)皿中的活體生長環(huán)境可以更好的保持一致，使得試驗數(shù)據(jù)更加準確；3、因活體煙苗是栽種在培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上的，使得整個試驗所需的空間大幅度減小，這樣可以同時對多種生防細菌進行篩選，且每組可以有多個重復，進一步提高試驗的準確性，可以在短暫的時間里篩選大量的未知細菌菌株；4、本方法篩選生防細菌所花費的時間為一般為20天左右，費用為10元左右， 相對現(xiàn)有的篩選方法可以節(jié)約時間70天，費用300元左右。在篩選出生防細菌后，對生防細菌的使用量也可直接采用活體進行測定，采用此方法選取合適的用量相對現(xiàn)有使用量篩選方法它簡便、快速、工作量少、高效、同時篩選結果準確可靠，可以在短暫的時間對大量生防細菌的用量完成測試，且此方法也可以應用于化學殺菌劑用量的測定。
具體實施例方式實施例1 以煙草黑脛病為例來詳細說明本生防細菌的篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上種植無菌煙苗，一組培養(yǎng)皿的數(shù)量一般為3個，每皿種植煙苗(品種紅花大金元)12株，所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm，在培養(yǎng)皿中添加營養(yǎng)液，時間一般為5-7天，待煙苗兩片子葉完全展開即可達到活體試驗的標準；
b、在得到活體試驗用的煙苗后，向培養(yǎng)皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液進行保護活性篩選；具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
(1)、從煙草種植大田的煙草染黑脛病區(qū)域中選該區(qū)域中無染黑脛病的煙株的土壤和煙葉；
(2)、采用細菌傳統(tǒng)NA培養(yǎng)基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態(tài)、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養(yǎng)；
(3)、(2)步驟所得單菌落菌株在NB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。能夠防治煙草黑脛病的細菌菌株的獲得可在活體煙苗培養(yǎng)期間完成；
C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液一起培養(yǎng)M小時后，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液，在每個培養(yǎng)皿中添加的煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液的數(shù)量為Iml X IO5個/ml。d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測施加的具有生防潛力的未知菌株的防治效果，篩選出防治煙草黑脛病的生防菌株。在得到煙草黑脛病的生防菌株后，在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)獲得細菌懸浮液，并將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌懸浮液添加到煙苗培養(yǎng)皿中，黑暗條件培養(yǎng)M小時后，在培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來判斷生防細菌的最佳防病濃度。為減少試驗量，濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌懸浮液按濃度可分為5-20份，如按9份來分，可將等體積的濃度為10、IO2、103、IO4、……IO9Cfu的生防細菌懸浮液加入到煙苗培養(yǎng)皿中，7天后確定效果最好的濃度范圍。實施例2 以煙草黑脛病為例來詳細說明化學殺菌劑甲霜靈防治此病害的濃度篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上種植無菌煙苗，一組培養(yǎng)皿的數(shù)量為7個，每培養(yǎng)皿內(nèi)種植12株煙苗，所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm，在培養(yǎng)皿中添加營養(yǎng)液，時間一般為5_7天， 待煙苗兩片子葉完全展開即可用于藥劑濃度的篩選；
b、配制25、12. 5,6. 25,3. 125、1. 5625,0. 78、0mg/L 系列濃度的甲霜靈藥液；
向培養(yǎng)皿中施加帶黑脛病病菌的游動孢子懸浮液；在每個培養(yǎng)皿中施加的煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液的數(shù)量為ImlX IO5個/升。C、向煙苗培養(yǎng)皿中添加Iml不同濃度的甲霜靈藥液，待煙苗和藥液一起培養(yǎng)12小時后，向培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上添加Iml X IO5個/ml的煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天，通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測不同濃度甲霜靈對煙草黑脛病的預防效果(保護活性測定)；
待煙苗和帶黑脛病病菌的游動孢子懸浮液一起培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)皿中施加含抗黑脛病性能的菌株培養(yǎng)液；
d、方法同c 一樣，待煙苗和煙草黑脛病病菌的游動孢子懸浮液一起培養(yǎng)12小時后，向煙苗培養(yǎng)皿中添加Iml不同濃度的甲霜靈藥液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測不同濃度甲霜靈對煙草黑脛病的治療效果(治療活性測定)。實施例3 以煙草黑脛病為例來詳細說明本生防細菌的篩選，其步驟如下
a、在一組以上的培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上種植無菌煙苗，一組培養(yǎng)皿的數(shù)量一般為3個，每皿種植煙苗(品種紅花大金元)12株，所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm，在培養(yǎng)皿中添加營養(yǎng)液，時間一般為5-7天，待煙苗兩片子葉完全展開即可達到活體試驗的標準；
b、在得到活體試驗用的煙苗后，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液進行治療活性篩選；
c、待煙苗和煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液一起培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液；具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的
(1)、從煙草種植大田的煙草染黑脛病區(qū)域中選該區(qū)域中無染黑脛病的煙株的土壤和煙葉；
(2)、采用細菌傳統(tǒng)NA培養(yǎng)基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態(tài)、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養(yǎng)；(3)、(2)步驟所得單菌落菌株在NB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。能夠防治煙草黑脛病的細菌菌株的獲得可在活體煙苗培養(yǎng)期間完成；
d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測施加的具有生防潛力的未知菌株的防治效果，篩選出防治煙草黑脛病的生防菌株。在得到煙草黑脛病的生防菌株后，在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)獲得細菌懸浮液，并將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌懸浮液添加到煙苗培養(yǎng)皿中，黑暗條件培養(yǎng)M小時后，在培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來判斷生防細菌的最佳防病濃度。為減少試驗量，濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌懸浮液按濃度可分為5-20份，如按9份來分，可將等體積的濃度為10、IO2、103、IO4、……IO9Cfu的生防細菌懸浮液加入到煙苗培養(yǎng)皿中，7天后確定效果最好的濃度范圍。
權利要求
1.一種針對煙草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟a、在一組以上的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)無菌煙苗，直至煙苗兩片子葉完全展開；b、在步驟a的基礎上，向培養(yǎng)皿中添加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液進行保護活性篩選；或在a步驟的基礎上，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液進行治療活性篩選；C、待煙苗和具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液一起培養(yǎng)M小時后，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液；或待煙苗和煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液一起培養(yǎng)M 小時后，向培養(yǎng)皿中施加具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液；d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測添加的具有生防潛力的未知菌株培養(yǎng)液的防治效果，選出能夠防治煙草黑脛病的生防菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述的針對煙草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特征在于 具有生防潛力的未知菌株是通過以下步驟得到的a、從煙草種植大田的煙草染病區(qū)域中選該區(qū)域中無染病煙株的土壤和煙葉；b、采用細菌傳統(tǒng)NA培養(yǎng)基，從所選取的土壤、葉片中分離不同顏色、形態(tài)、生長速率的細菌，將這些細菌再次劃線純培養(yǎng)；c、b步驟所得單菌落菌株在NB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜得具有生防潛力的未知菌株。
3.根據(jù)權利要求1所述的針對煙草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特征在于 所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm。
4.根據(jù)權利要求3所述的針對煙草黑脛病的生物防治細菌的篩選方法，其特征在于 在每個培養(yǎng)皿中添加的煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液的數(shù)量為ImlX IO5個/ml。
5.如專利要求1-4所述的針對煙草黑脛病的生物防治細菌用量的篩選方法，其特征在于在得到生防菌株后，將其配成細菌菌懸液，并將濃度分別為10 Cfu-IO9 Cfu的細菌菌懸液加入到煙苗培養(yǎng)皿中，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來判斷對最佳的生防菌株和生防細菌的最佳防病濃度。
6.根據(jù)權利要求5所述的針對煙草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特征在于 濃度為10 Cfu-IO9 cfu的生防細菌培養(yǎng)液按濃度被分為5-20份添加到煙苗培養(yǎng)皿中，通過防病效果來篩選得到最佳細菌用量。
7.根據(jù)權利要求5所述的針對煙草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特征在于 所述的生防細菌可以為現(xiàn)有已知的化學殺菌劑。
8.根據(jù)權利要求1所述的針對煙草黑脛病的生防細菌用量的篩選方法，其特征在于 在培養(yǎng)皿中鋪設有濾紙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種針對煙草黑脛病的生防細菌及其用量的篩選方法，該方法包括以下步驟a、在培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上培養(yǎng)無菌煙苗，b、在步驟a的基礎上，向培養(yǎng)皿中添加具有生防潛能的細菌培養(yǎng)液；c、待煙苗和具生防潛能的細菌菌懸液一起培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)皿中添加煙草黑脛病菌的游動孢子懸浮液；d、在c步驟基礎上，給予煙苗正常生長條件，7天后通過觀察煙苗的發(fā)病情況來檢測添加的具生防潛力細菌的防治效果，篩選出能夠防治煙草黑脛病的生防細菌。本發(fā)明同傳統(tǒng)方法相比，具有許多優(yōu)點，它簡便、快速、工作量少、高效、同時篩選結果準確可靠，可以在短暫的時間里從大量未知細菌中篩選出具有生防功能的細菌。
文檔編號C12R1/645GK102277408SQ201110231990
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權日2011年8月15日
發(fā)明者夏海乾, 李文紅, 汪漢成, 王晶君, 石俊雄 申請人:貴州省煙草科學研究所