專利名稱：一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法
技術領域：
本發明屬于植物病蟲害檢疫領域，尤其涉及一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法。
背景技術：
煙草是一年生草本植物，屬于茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)，在世界上分布廣泛，目前發現的煙草屬有66個種。2010年，全國煙草行業實現稅利超過6000億元。煙草黑脛病是煙草生產上最具毀滅性的侵染性病害之一，在我國常年發病率維持在10-15%， 發病面積約76372hm2，造成的年損失產量約觀69. ^Kg,經濟損失達1. 23億元人民幣以上。 目前的研究表明，土壤中黑脛病病原菌的數量與煙草黑脛病的發生密切相關。因此，檢測土壤中煙草黑脛病菌的數量，可以及早進行預防，降低黑脛病的發生。目前常用的土壤中黑脛病菌的檢測方法主要是通過菌體培養和普通的PCR方法，這兩種方法具有準確性低、費時和重復性差等缺點。而熒光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time Q-PCR)方法是一種靈敏度高、穩定性好、省時的檢測技術，并具有自動化的特點，檢測結果可在10 1012拷貝范圍，在國內外病原微生物的檢測中具有廣泛的應用。通過該方法對土壤中的煙草黑脛病菌進行熒光定量PCR檢測，同時參考標準曲線，可以檢測土壤中煙道黑脛病菌的數量，為預防煙草黑脛病的發生提供了前提和保障。

發明內容
本發明提供了一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，旨在解決目前常用的土壤中黑脛病病菌的檢測方法主要是通過菌體培養和普通的PCR方法，這兩種方法準確性低、費時和重復性差的問題。本發明的目的在于提供一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，該方法包括以下步驟該方法包括以下步驟取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB法提取基因組 DNA ；提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA ；根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA進行定量分析。本發明提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，對土壤中煙草黑脛病菌進行 DNA提取以及分子檢測，省去了傳統的分離培養的方法，在時間上大大縮短了檢測周期，整個檢測0. 5天即可完成，與普通PCR檢測方法相比，無需后續的處理過程，并且能對結果進行實時監測，設計的引物是基于病原菌ITS的易變區域設計的，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，經與近似菌種擴增驗證，特異性好，適于熒光定量PCR反應條件，增加了土壤中總DNA的提取方法，在土壤總DNA提取緩沖液加入了 2%的PVP，有效地去除了土壤中部分雜質的污染，減少了對PCR效果的影響，大大提高了熒光定量PCR的檢測靈敏度，同時熒光定量PCR的體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，操作簡單，檢測靈敏度高，可以達到2fg/ μ 1，土壤中只有一個病原孢子的存在，即可檢出。


圖1是本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法的實現流程圖；圖2是本發明實施例提供的利用CTAB法提取基因組DNA的實現方法的流程圖；圖3是本發明實施例提供的提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA的實現方法的流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明， 并不用于限定發明。圖1示出了本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法的實現流程。該方法包括以下步驟在步驟SlOl中，取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB 法提取基因組DNA ；在步驟S102中，提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA ；在步驟S103中，根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；在步驟S104中，檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；在步驟S105中，利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的 DNA進行定量分析。在本發明實施例中，取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養進一步包括PDA液體培養基過夜培養后，取1. 5mL菌液，收集菌絲體，雙蒸水洗滌2次。如圖2所示，在本發明實施例中，利用CTAB法提取基因組DNA的實現方法為在步驟S201中，加入500 μ 1的CTAB溶液，液氮中冷卻30s，立即放入65°C水浴中 30s，重復3次；在步驟S202中，加入玻璃珠漩渦振蕩5min，65°C保溫20min，期間搖動一次；在步驟S203中，加入酚、氯仿、異戊醇，體積比25 24 1，12000r/min離心 lOmin，上清液中加入氯仿、異戊醇，體積比24 1，12000r/min離心IOmin ；在步驟S204中，取上清，加入2/3倍體積的_20°C預冷異丙醇沉淀，靜置約30min ；
在步驟S205中，低轉速離心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次， 吹干，重懸于IOOul雙蒸水中，_20°C保存備用。如圖3所示，在本發明實施例中，提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA的實現方法為在步驟S301中，制備分生孢子懸浮液并接種土壤，每份土壤3個重復；在步驟S302中，土壤樣品中加入DNA提取緩沖液，37°C溫浴30min，每5min混勻；在步驟S303中，加入20% SDS，終濃度為2%，65°C水浴濁，每IOmin顛倒混勻， 6000g室溫離心IOmin ；在步驟S304中，加入酚、氯仿、異戊醇，三者體積比為25 24 1，12000r/min離心lOmin，上清液中加入氯仿、異戊醇，二者體積比為24 1，12000r/min離心IOmin ；在步驟S305中，取上清，加入2/3倍體積的_20°C預冷異丙醇沉淀，靜置約30min ；在步驟S306中，低轉速離心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次， 吹干，重懸于IOOul雙蒸水中，_20°C保存備用。在本發明實施例中，DNA提取緩沖液中加入了 2%的PVP，用于去除土壤中部分雜質的污染、減少對PCR效果的影響、提高熒光定量PCR 的檢測靈敏度。在本發明實施例中，土壤總DNA提取緩沖液的組成為pH 值為 8.0 的 100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA_Na2，2 % PVP,1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB, 125μ g/mL 蛋白酶 K。在本發明實施例中，根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證的實現方法為根據NCBI數據庫中煙草黑脛病病菌的18S rDNA基因序列，利用 Primer5. 0 設計熒光定量 PCR 特異引物 SP 5 ‘ -TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3 ‘ , AP 5，-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3 ‘，擴增目的片段長度為 172bp ；將提取的煙草黑脛病病原菌基因組DNA和其他致病真菌的基因組DNA進行引物特異性檢測。在本發明實施例中，該方法中設計引物特異性好，相近物種擴增時沒有相應條帶， 所得產物的大小為172bp，適于熒光定量PCR反應條件。在本發明實施例中，該方法中熒光定量PCR的擴增體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，與所設計的引物相適應；其中，熒光定量PCR的擴增體系為IXSYBR Green I Master Mix(TaKaRa) 10 μ 1，引物各為 400nM，模板 2 μ L，擴增體系為25μ L ；熒光定量PCR的反應程序為94°C預變性 5min，94°C變性 20s，65°C退火 40s，72°C延伸 40s, 72°C 5min，40 個循環。在本發明實施例中，檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線的實現方法為以接種不同濃度病菌分生孢子的土壤DNA為模板，檢驗該引物對土壤中分生孢子的靈敏度；以煙草黑脛病病菌基因組DNA的10倍梯度稀釋液為模板，檢驗引物SP/AP對基因組DNA的靈敏度，其檢測下限為2fg/y 1基因組DNA，說明該引物具有很高的靈敏度；選取不同稀釋梯度的DNA為模板，熒光定量PCR擴增，制作熒光定量PCR標準曲線。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。如圖1所示，本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，其步驟如下(1)真菌培養及基因組DNA提取取低溫保存的的煙草黑脛病原菌和其他致病真菌活化培養，PDA液體培養基過夜培養后，取1.5mL菌液，收集菌絲體，雙蒸水洗滌2 次；如圖2所示，CTAB法提取基因組DNA ①加入500 μ 1的CTAB溶液，液氮中冷卻 30s，立即放入65°C水浴中30s，重復3次；②加入玻璃珠漩渦振蕩5min，65°C保溫20min，期間搖動一次；③加入酚、氯仿、異戊醇，三者體積比為25 24 l，12000r/min離心lOmin， 上清液中加入氯仿、異戊醇，二者體積比為M l，12000r/min離心IOmin;④取上清，加入 2/3倍體積的_20°C預冷異丙醇沉淀，靜置約30min ；⑤低轉速離心，沉淀用70%乙醇漂洗2 次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于IOOul雙蒸水中，-20°C保存備用。(2)黑脛病菌土壤總DNA的提取如圖3所示，制備分生孢子懸浮液并接種土壤， 每份土壤3個重復；土壤樣品中加入DNA提取緩沖液，37°C溫浴30min，每5min混勻；然后加入20% SDS (終濃度為2% )，65°C水浴2h，每IOmin顛倒混勻，6000g室溫離心lOmin， 以下處理步驟參照上述(1)方法中的步驟③ ⑤。該方法所得DNA的O擬60/0擬80為 1. 58 1. 81，提取到的DNA純度較高，可以用以PCR擴增。土壤總DNA提取緩沖液的組成為IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8. 0), 100mmol/L EDTA-Na2, 2% PVP, 1. 5mol/L NaCl, 1%CTAB, 125μ g/mL 蛋白酶 K。(3)引物的設計及特異性PCR擴增驗證根據NCBI數據庫中煙草黑脛病菌的18S rDNA基因序列，利用ft~imer5. O設計熒光定量PCR特異引物SP 5 ‘ -TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3 ‘，AP :5，CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3 ‘，擴增目的片段長度為17^p，引物由上海生工合成；將提取的煙草黑脛病病原菌基因組DNA和其他致病真菌的基因組DNA進行引物特異性檢測，常規PCR擴增體系(25 μ 1)為=IOmM的dNTP2 μ 1，20mM的MgC122 μ 1，ρΗ8· 6 緩沖液2. 5 μ 1，雙蒸水16μ 1，10μΜ的上下游引物各0. 5μ l，2u/deTaq酶1μ 1，DNA模板 0. 5μ 1。PCR反應條件是95°C預變性30s，95°C變性5s，60°C退火30s，35次循環。PCR產物以1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，只有煙草黑脛病病原菌基因組檢測到約170bp的條帶， 表明引物設計特異性好。(4)檢測靈敏度分析和標準曲線的制作以接種不同濃度病菌分生孢子的土壤 DNA為模板，檢驗該引物對土壤中分生孢子的靈敏度；以煙草黑脛病病菌基因組DNA的10 倍梯度稀釋液為模板，檢驗引物SP/AP對基因組DNA的靈敏度，其檢測下限為2fg/y 1基因組DNA，說明該引物具有很高的靈敏度。同時，選取不同稀釋梯度的DNA為模板，熒光定量PCR擴增，制作標準曲線。熒光定量PCR擴增體系為1XSTOR Green (R) I Master Mix(TaKaRa)IOy 1，引物各為400nM，模板2 μ L，擴增體系為25 μ L0反應程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 20s，65°C退火 40s，72°C延伸 40s, 72°C 10min，40 個循環。
(5)熒光定量PCR技術的應用提取不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA，用熒光定量PCR標準曲線進行定量分析，發現土壤中煙草黑脛病菌的數量與相應地塊煙草的發病
程度一致。本發明提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，對土壤中煙草黑脛病菌進行 DNA提取以及分子檢測，省去了傳統的分離培養的方法，在時間上大大縮短了檢測周期，整個檢測0.5天即可完成；與普通PCR檢測方法相比，無需后續的處理過程，并且能對結果進行實時監測；本發明設計的引物是基于病原菌ITS的易變區域設計的，經與近似菌種擴增驗證，特異性好。本發明檢測靈敏度高，可以檢測出2fg/y 1的DNA，土壤中只有一個病原孢子的存在，即可檢出。總之，本發明具有操作比較簡單、靈敏度高等優點。本發明積極效果和優勢在于在于(1)增加了土壤中總DNA的提取方法，土壤總 DNA提取緩沖液加入了 2%的PVP，能夠去除土壤中部分雜質(如腐植酸等類物質)的污染，減少了對PCR效果的影響，大大提高了熒光定量PCR的檢測靈敏度；( 設計引物特異性好，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，適于熒光定量PCR反應條件；C3)熒光定量PCR的體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，與所設計的引物相適應。焚光定量 PCR 擴增體系為1 X SYBR Green I Master Mix(TaKaRa)IOyUI 物各為400nM，模板2 μ L，擴增體系為25 μ L ；反應程序為94°C預變性5min ；94°C變性20s， 65°C退火40s，72°C延伸40s，72°C 5min，40個循環。綜合上述條件，本發明提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，檢測靈敏度更高，可以達到2fg/yl，高于現有技術提供的 0.6IOfg/μ 1的檢測線。本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，本發明提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，對土壤中煙草黑脛病菌進行DNA提取以及分子檢測，省去了傳統的分離培養的方法，在時間上大大縮短了檢測周期，整個檢測0.5天即可完成， 與普通PCR檢測方法相比，無需后續的處理過程，并且能對結果進行實時監測，設計的引物是基于病原菌ITS的易變區域設計的，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，經與近似菌種擴增驗證，特異性好，適于熒光定量PCR反應條件，增加了土壤中總 DNA的提取方法，在土壤總DNA提取緩沖液加入了 2%的PVP，有效地去除了土壤中部分雜質的污染，減少了對PCR效果的影響，大大提高了熒光定量PCR的檢測靈敏度，同時熒光定量PCR的體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，操作簡單，檢測靈敏度高，可以達到2fg/ μ 1，土壤中只有一個病原孢子的存在，即可檢出。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB法提取基因組DNA ； 提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA ；根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA進行定量分析。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養進一步包括PDA液體培養基過夜培養后，取1. 5mL菌液，收集菌絲體，雙蒸水洗滌2次。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用CTAB法提取基因組DNA的實現方法為加入500 μ 1的CTAB溶液，液氮中冷卻30s，立即放入65°C水浴中30s，重復3次； 加入玻璃珠漩渦振蕩5min，65°C保溫20min，期間搖動一次；加入酚、氯仿、異戊醇，體積比25 24 l，12000r/min離心lOmin，上清液中加入氯仿、異戊醇，體積比24 1，12000r/min離心IOmin ；取上清，加入2/3倍體積的-20°C預冷異丙醇沉淀，靜置約30min ； 低轉速離心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于IOOul雙蒸水中，-20°C保存備用。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA的實現方法為制備分生孢子懸浮液并接種土壤，每份土壤3個重復； 土壤樣品中加入DNA提取緩沖液，37°C溫浴30min，每5min混勻； 加入20% SDS，終濃度為2%，65°C水浴2h，每IOmin顛倒混勻，6000g室溫離心IOmin ； 加入酚、氯仿、異戊醇，三者體積比為25 24 l，12000r/min離心lOmin，上清液中加入氯仿、異戊醇，二者體積比為24 1，12000r/min離心IOmin ；取上清，加入2/3倍體積的-20°C預冷異丙醇沉淀，靜置約30min ； 低轉速離心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于IOOul雙蒸水中，-20°C保存備用。
5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述DNA提取緩沖液中加入了2%的 PVP，用于去除土壤中部分雜質的污染、減少對PCR效果的影響、提高熒光定量PCR的檢測靈敏度。
6.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述土壤總DNA提取緩沖液的組成為 PH 值為 8. O 的 100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L EDTA-Na2,2% PVP, 1. 5mol/L NaCl,1% CTAB, 125μ g/mL 蛋白酶 K。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證的實現方法為根據NCBI數據庫中煙草黑脛病病菌的18S rDNA基因序列，利用ft~imer5. 0 設計熒光定量 PCR 特異弓丨物 SP :5 ‘ -TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3 ‘ , AP ·5，-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3 ‘，擴增目的片段長度為 172bp ；將提取的煙草黑脛病病原菌基因組DNA和其他致病真菌的基因組DNA進行引物特異性檢測。
8.如權利要求1或7所述的方法，其特征在于，該方法中設計引物特異性好，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，適于熒光定量PCR反應條件。
9.如權利要求1或7所述的方法，其特征在于，該方法中熒光定量PCR的擴增體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，與所設計的引物相適應；其中，熒光定量PCR的擴增體系為1 X SYBR Green I Master Mix (TaKaRa) 10 μ 1，引物各為 400ηΜ,模板 2 μ L,擴增體系為 25μ L ；熒光定量PCR的反應程序為·94°C預變性 5min，94°C變性 20s，65°C退火 40s，72°C延伸 40s, 72°C 5min，40 個循環。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線的實現方法為以接種不同濃度病菌分生孢子的土壤DNA為模板，檢驗該引物對土壤中分生孢子的靈敏度；以煙草黑脛病病菌基因組DNA的10倍梯度稀釋液為模板，檢驗引物SP/AP對基因組 DNA的靈敏度，其檢測下限為2fg/y 1基因組DNA，說明該引物具有很高的靈敏度；選取不同稀釋梯度的DNA為模板，熒光定量PCR擴增，制作熒光定量PCR標準曲線。
全文摘要
本發明屬于植物病蟲害檢疫領域，提供了一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，對土壤中煙草黑脛病菌進行DNA提取以及分子檢測，省去了傳統分離培養的方法，在時間上大大縮短了檢測周期，與普通PCR檢測方法相比，無需后續的處理過程，并能對結果進行實時監測，設計引物是基于病原菌ITS的易變區域設計的，相近物種擴增時沒有相應條帶，特異性好，適于熒光定量PCR反應條件，土壤總DNA提取緩沖液加入了2％的PVP，有效地去除了土壤中部分雜質的污染，減少了對PCR效果的影響，提高了熒光定量PCR的檢測靈敏度，同時熒光定量PCR的體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，檢測靈敏度高，可以達到2fg/μl。
文檔編號C12Q1/06GK102399896SQ201110402300
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者馮超, 孔凡玉, 張成省, 張玉芹, 李霞, 王新偉, 王曉飛, 王靜, 闞光鋒, 陳雪 申請人:中國農業科學院煙草研究所