專利名稱：一種乳酸乳球菌乳脂亞種菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物新菌株及其應用，具體涉及一種乳酸乳球菌乳脂亞種菌株V401-403及由該菌株制備蛋乳發酵飲料的方法及制得的蛋乳發酵飲料。
背景技術：
雞蛋中含有人體所必需的優良蛋白質、脂肪、卵磷脂與多種磷脂質、礦物質、維生素等營養物質，其營養豐富，是一種十分理想的蛋白質食物；牛乳除含有豐富的蛋白質、鈣、無機鹽、維生素和多不飽和脂肪酸，是老少皆宜的營養食品。蛋乳兩者結合使氨基酸更加平衡，利于吸收和利用。牛乳除含有豐富營養成分外，還含有較多的乳糖。通過有益乳酸菌發酵，可以轉化乳糖，消除乳糖不耐受反應，生成具有多種功能性的胞外多糖、新的免疫調節因子和多種功能性多肽益生成分，容易消化吸收，調節腸道功能，有其他食品無法代替的作用。胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離、分泌到環境中的水溶性多糖，屬于微生物的次級代謝產物。對微生物的生長有重要意義。乳酸菌EPS還具有降低小鼠血液膽固醇含量、抗腫瘤以及促進益生菌與腸黏膜的吸附等重要生理活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種乳酸乳球菌乳脂亞種菌株V401-403。本發明菌株V401-403是從伊犁牧區農家的酸馬奶中分離篩選到的一株乳酸乳球菌乳脂亞種菌株(Lactoccous lactis subsp. Cremoris)新菌株，已于2011年5月16日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號 CGMCC No 4849。該菌株具體通過如下方法分離得到取酸馬奶樣品5mL,放入盛有45mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，置于搖床振蕩5min后，梯度稀釋；取10_4、10_5、10_6三個稀釋度進行涂布，于37°C培養48-7 ;挑取單菌落分別培養后，劃線分離，重復劃線操作，直至鏡檢菌體細胞形態一致時認為菌株分離完成。該菌株具有如下特性該菌呈鏈球狀，為革蘭氏陽性菌。該菌株產胞外多糖能力強。本發明菌株V401-403的16S rDNA序列與目前發表的乳酸乳球菌乳脂亞種的16SrDNA，同源性達到95%以上。綜合形態特征與16SrDNA序列鑒定，V401-403為乳酸乳球菌乳脂亞種新菌株(Lactoccous lactis subsp. cremoris.)。本發明還提供由乳酸乳球菌乳脂亞種菌株V401-403制備蛋乳發酵飲料的方法。所述方法是將雞蛋液與水混合后，與經過巴氏殺菌的原料奶進行混合，并攪拌均勻，加入甜味劑經過過濾得到蛋奶混合液，然后將在原料奶中接種了乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403后制得的生產用發酵劑接種到上述制得的蛋奶混合液中，攪拌均勻后制得。所述方法具體包括下述步驟
I)將雞蛋液與水按照I : O. 5-2的體積比混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60_85°C下滅菌15min_lh ；3)取原料奶，在65-90°C下，經過30s-30min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的原料奶在無菌條件下按照I : 1-2 (v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑,過濾,冷卻到45-55 °C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在10_25MPa壓力下進行均質處理1_2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5-15% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的原料奶中，培養至菌密度達I X IO8-I X 10ncfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到30_43°C，按2_10%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在0-8 °C成熟12-38h，于4-8°C下冷藏。優選地，所述方法包括下述步驟I)將雞蛋液與水按照I : 1-2的體積比混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60_80°C下滅菌15_30min ；3)取原料奶，在70_80°C下，經過3_20min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的牛乳在無菌條件下按照I : l_1.8(v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑,過濾,冷卻到45-55 °C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在15_20MPa壓力下進行均質處理1_2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5-15% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的牛乳中，培養至菌密度達lX109-lX101(lCfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到35_40°C，按2_6%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在2-6°C成熟18-36h，于4-8°C下冷藏。更優選地，所述方法下述步驟I)將雞蛋液與水按照I : I的體積比混合，充分攪拌均勻；2)將步驟I)中得到的雞蛋液在65°C下滅菌30min ；3)取原料奶，在68°C下，經過15min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的牛乳在無菌條件下按照I : l(v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑，過濾，冷卻到50°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在20MPa壓力下進行均質處理I次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的牛乳中，培養至菌密度達I X IO9-I X 10ncfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到38°C，按4%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在4°C成熟24h，于4-8 °C下冷藏。
所述步驟6)中的乳酸乳球菌乳脂亞種為乳酸乳球菌乳脂亞種菌株(Lactoccouslactis subsp. Cremoris) V401-403，其保藏號為 CGMCC No 4849。所述步驟I)中的雞蛋液為全蛋液、蛋白液或蛋黃液。所述步驟4)中的甜味劑的量占蛋奶混合液的2-12%。優選地，所述步驟4)中的甜味劑的量占蛋奶混合液的4_10%。所述原料奶為還原奶或鮮奶，可為牛奶、羊奶、或其他哺乳動物奶，優選為牛奶。
所述雞蛋液通過下述方法制得用清水清洗蛋殼，然后用2%次氯酸溶液浸泡5min，晾干外殼后，在潔凈生產線上進行蛋液生產，即經蛋殼切割、蛋殼掰分、蛋液(蛋清、蛋黃或全蛋)收集、在60-70°C下，經過3-10min巴氏殺菌處理后，冷卻至4_10°C，備用。所述分裝為無菌灌裝、杯裝或瓶裝。制得的蛋乳發酵飲料中，每罐、每杯或每瓶的雞蛋液含量按質量比為15-30%。本發明還提供由上述方法制得的蛋乳發酵飲料。本發明提供的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株V401-403，該菌株產胞外多糖能力強。制備本發明提供的蛋乳發酵飲料時，采用優質的乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactoccous lactis subsp. cremoris)菌株V401-403進行發酵,使得制得的發酵飲料具有優良的生產理化特性、風味特性、以及色澤和質地，含有豐富的胞外多糖，具有良好的口感與風味，粘度適中。


圖I為在顯微鏡下觀察的乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403菌株的圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下述實施例中使用的納豆膏及松花蛋膏按照如下方法制備。制備蛋清液用清水清洗蛋殼,然后用2%次氯酸溶液浸泡5min，晾干外殼后,在潔凈生產線上進行蛋液生產，即經蛋殼切割、蛋殼掰分、蛋清收集、在60°C下，經過5min巴氏殺菌處理后，冷卻至6°C，備用。制備蛋黃液用清水清洗蛋殼,然后用2%次氯酸溶液浸泡5min，晾干外殼后，在潔凈生產線上進行蛋液生產，即經蛋殼切割、蛋殼掰分、蛋黃收集、60°C下，經5min巴氏殺菌處理，冷卻至6 °C，備用。制備全蛋液用清水清洗蛋殼,然后用2%次氯酸溶液浸泡5min，晾干外殼后,在潔凈生產線上進行蛋液生產，即經蛋殼切割、蛋殼掰分、全蛋收集、在60°C下，經過5min巴氏殺菌處理后，冷卻至6°C，備用。實施例I蛋乳發酵飲料的制備I)將上述制備得到的IL蛋清液與IL水混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在65°C下滅菌30min ；3)取2L新鮮標準化牛奶，在68°C下，經過15min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的2L經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的2L經過巴氏殺菌的牛奶在無菌條件下混合攪拌均勻，加入240g甜味劑(蔗糖)，過濾，冷卻到50°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在20MPa壓力下進行均質處理I次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的新鮮標準化牛奶中，培養至菌密度達lxl01(lcfu/mL，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到38°C，按4%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在4°C成熟24h，制得蛋奶，于4°C下冷藏。實施例2蛋乳發酵飲料的制備I)將上述制備得到的IL全蛋液與O. 5L水混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60°C下滅菌Ih ；3)取3L新鮮標準化牛奶，在65°C下，經過30min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的I. 5L經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的4L經過巴氏殺菌的牛奶在無菌條件下混合攪拌均勻，加入120g甜味劑(蔗糖)，過濾，冷卻到45°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在IOMPa壓力下進行均質處理I次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按15% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的新鮮標準化牛奶中，培養至菌密度達lxlOncfu/mL，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到30°C，按2%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在0°C成熟12h，制得蛋奶，于8°C下冷藏。實施例3蛋乳發酵飲料的制備I)將上述制備得到的IL蛋黃液與2L水按混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在85°C下滅菌15min ；3)取3L新鮮標準化牛奶，在90°C下，經過30s巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的3L經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的3L經過巴氏殺菌的牛奶在無菌條件下混合攪拌均勻，加入720g甜味劑(蔗糖)，過濾，冷卻到50°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在25MPa壓力下進行均質處理2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的新鮮標準化牛奶中，培養至菌密度達IX 108cfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到43°C，按10%的體積比接種步驟
6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在8°C成熟38h，制得蛋奶，于4°C下冷藏。實施例4蛋乳發酵飲料的制備I)將上述制備得到的IL蛋清液與IL水按混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在80°C下滅菌30min ；3)取3L新鮮標準化牛奶，在70°C下，經過3min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的2L經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的I. 8L經過巴氏殺菌的牛奶在無菌條件下混合攪拌均勻，加入152g甜味劑(蔗糖)，過濾，冷卻到55°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在20MPa壓力下進行均質處理2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的新鮮標準化牛奶中，培養至菌密度達lX101(lCfU/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到35°C，按2%的體積比接種步驟
6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在6°C成熟18h，制得蛋奶，于4°C下冷藏。實施例5蛋乳發酵飲料的制備I)將上述制備得到的IL蛋黃液與IL水按混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60°C下滅菌30min ；3)取3L新鮮標準化牛奶，在80°C下，經過20min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的2L經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的2L經過巴氏殺菌的牛奶在無菌條件下混合攪拌均勻，加入400g甜味劑(蔗糖)，過濾，冷卻到45°C，得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在15MPa壓力下進行均質處理2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按15% (v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的新鮮標準化牛奶中，培養至菌密度達IX 109cfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到40°C，按6%的體積比接種步驟
6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在2°C成熟36h，制得蛋奶，于4°C下冷藏。對比例將市售的酸奶作為對比例。對對比例及實施例一得到的產品進行感官實驗評價，具體方法如下采用不記名打分的方式進行100人評分測評。口感、滋味、氣味、組織狀態、整體感覺5項指標進行打分，滿分為100分，分數越高，標示產品效果越好，對品嘗結果進行統計分析，結果如下表I所示。表I
權利要求
1.乳酸乳球菌乳脂亞種菌株(Lactoccouslactis subsp. cremoris) V401-403,其保藏號為CGMCC No 4849。
2.一種通過權利要求I所述的乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403發酵制備蛋乳發酵飲料的方法，其是將雞蛋液與水混合后，與經過巴氏殺菌的原料奶進行混合，并攪拌均勻，加入甜味劑經過過濾得到蛋奶混合液，然后將在原料奶中接種了乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403后制得的生產用發酵劑接種到上述制得的蛋奶混合液中，攪拌均勻后制得。
3.根據權利要求2所述的制備蛋乳發酵飲料的方法，其特征在于，該方法包括下述步驟1)將雞蛋液與水按照I: O. 5-2的體積比混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60-85°C下滅菌15min-lh；3)取原料奶，在65-90°C下，經過30s-30min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的原料奶在無菌條件下按照I : l_2(v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑,過濾,冷卻到45-55°C,得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在10-25MPa壓力下進行均質處理1_2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5-15%(v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的原料奶中，培養至菌密度達I X IO8-I X 10ncfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到30-43°C，按2-10%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在0-8 °C成熟12-38h。
4.根據權利要求2或3所述制備蛋乳發酵飲料的方法，其包括下述步驟1)將雞蛋液與水按照I: 1-2的體積比混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在60-80°C下滅菌15-30min；3)取原料奶，在70-80°C下，經過3-20min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的牛乳在無菌條件下按照I : l_1.8(v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑,過濾,冷卻到45-55°C,得到蛋奶混合液；5)將蛋奶混合液在15-20MPa壓力下進行均質處理1_2次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5-15%(v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的牛乳中，培養至菌密度達I X IO9-I X KTcfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到35-40°C，按2-6%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在2-6°C成熟18-36h。
5.根據權利要求2-4任一項所述制備蛋乳發酵飲料的方法，其包括下述步驟1)將雞蛋液與水按照I: I的體積比混合，充分攪拌均勻，得到雞蛋液水溶液；2)將步驟I)中得到的雞蛋液水溶液在65°C下滅菌30min；3)取原料奶，在68°C下，經過15min巴氏殺菌處理后，冷卻至60°C，備用；4)將步驟2)中得到的經過滅菌的雞蛋液水溶液和步驟3)中得到的經過巴氏殺菌的牛乳在無菌條件下按照I : I (v/v)混合攪拌均勻，并加入甜味劑，過濾，冷卻到50°C，得到蛋奶混合液； 5)將蛋奶混合液在20MPa壓力下進行均質處理I次；6)將深凍乳酸乳球菌乳脂亞種按5%(v/v)接種到按照步驟3)制備的經過巴氏滅菌的牛乳中，培養至菌密度達lX109-lX101(lCfu/ml，作為生產用發酵劑；7)將步驟5)中均質處理后的蛋乳混合液冷卻到38°C，按4%的體積比接種步驟6)中得到的生產用發酵劑，攪拌均勻后無菌分裝，置于37°C恒溫培養箱中發酵IOh取出，然后在4°C 成熟 24h。
6.根據權利要求2-5任一項所述制備蛋乳發酵飲料的方法，其特征在于，所述步驟6)中的乳酸乳球菌乳脂亞種為乳酸乳球菌乳脂亞種菌株(Lactoccous lactis subsp.Cremoris) V401-403，其保藏號為 CGMCC No 4849。
7.根據權利要求2-5任一項所述的制備蛋乳發酵飲料的方法，其特征在于，所述步驟I)中的雞蛋液為全蛋液、蛋白液或蛋黃液。
8.根據權利要求2-5任一項所述制備蛋乳發酵飲料的方法，其特征在于，所述步驟4)中的甜味劑的量占蛋奶混合液的2-12%。
9.根據權利要求8所述制備蛋乳發酵飲料的方法，其特征在于，所述步驟4)中的甜味劑的量占蛋奶混合液的4-10%。
10.根據權利要求2-9任意一項所述方法制備的蛋乳發酵飲料。
全文摘要
本發明涉及乳酸乳球菌乳脂亞種菌株及其應用。具體地，本發明提供一株乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403(Lactoccous lactis subsp.cremoris)。其是從酸馬奶中分離得到，其保藏號為CGMCC No 4849。本發明還提供由上述菌株制備蛋乳發酵飲料的方法及制得的蛋乳發酵飲料。上述方法是將雞蛋液與水混合后，與經過巴氏殺菌的原料奶進行混合，并攪拌均勻，加入甜味劑經過過濾得到蛋奶混合液，然后將在原料奶中接種了乳酸乳球菌乳脂亞種V401-403后制得的生產用發酵劑接種到上述制得的蛋奶混合液中，攪拌均勻后制得。從而使制得的蛋奶發酵飲料胞外多糖含量豐富、具有良好的口感與風味，粘度適中。
文檔編號C12N1/20GK102952758SQ20111023652
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月17日 優先權日2011年8月17日
發明者盧曉明, 陳尚武, 劉旭明, 盧相義, 左芳雷, 孫曉菲 申請人:北京德青源農業科技股份有限公司