專利名稱：一種發酵生產尼莫克汀的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵生產抗生素技術領域，特別涉及尼莫克汀的發酵生產。更具體的，涉及通過向發酵液中連續補加或間歇補加高濃度單糖、二糖或多糖溶液來培養藍灰鏈霉菌，以達到生產高濃度尼莫克汀的方法。
背景技術：
尼莫克汀(Nemadectin)是一種十六元大環內酯類抗生素，由藍灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp. Noncyanogenus)經發酵過程生產。作為米爾貝霉素族的一員，尼莫克汀主要用于合成活性更強的農藥獸藥莫西克汀(Moxidectin)。莫西克汀20世紀80年代中期以來開始作為獸用驅蟲藥使用，能夠高效的殺滅線蟲和體表寄生蟲，同時對動物有很好的安全性，是目前被廣泛用于獸醫臨床的廣譜、高效、新型大環內酯類驅蟲抗 生素。尼莫克汀結構式
H3CX11^CH3
H3C0P ￥ γΛ/ 3
hAi ^
Η OH尼莫克汀的制備主要通過藍灰鏈霉菌菌株生物發酵制得。目前的發酵生產工藝初始糖濃度較高，菌種進入次級代謝過程較慢，發酵產物合成過程易受到阻遏，且發酵中后期菌絲裂解過快，發酵結束時的產量還有待提高(朱皖宜，羅紅瑜，張賽萍，等.尼莫克丁產生菌的誘變育種[J].生物學雜志，2008，25 (2) :62)。

發明內容
本發明的目的在于，針對現有尼莫克汀發酵工藝存在的不足，基于微生物生長動力學基礎，提供一種能夠提高尼莫克汀收率的液體發酵過程的補糖方法。為了實現本發明的目的，發明人提供了如下發酵生產尼莫克汀的方法，即在發酵生產尼莫克汀的過程中補加糖類物質，包括單糖、二糖或多糖。發明人在研究中發現，當在發酵生產尼莫克汀的過程中補加糖類物質，包括單糖、二糖或多糖后，其發酵水平具有顯著的提高。為此，發明人作了進一步研究并得出了更為改進的生產方法。其技術方案如下
一種發酵生產尼莫克汀的方法，在發酵生產尼莫克汀的過程中，當發酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發酵液間歇或連續補加糖類物質，使發酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發酵。所述糖類物質可以是單糖、二糖或多糖，或者是它們的混合物。所述單糖如葡萄糖、果糖；所述二糖為代謝能夠產生葡萄糖的二糖，如乳糖、蔗糖、麥芽糖等；所述多糖為分解能產生單糖的可溶性淀粉、糊精、麥芽糊精等(注麥芽糊精為以淀粉為原料，經控制水解DE值在20%以下的產品；糊精為淀粉在受到加熱、酸或淀粉酶作用下將大分子轉化成為小分子的中間物質，行業內通常將兩者區分開來作為不同的原材料)。優選地，上述發酵生產尼莫克汀的方法中，補糖的形式可以是將糖類物質配制為300-600g/L單糖、二糖和/或多糖的單一或混合溶液，然后間歇補加或連續補加到發酵液中。優選地，上述發酵生產尼莫克汀的方法中，將發酵液的初始溶氧設定為100%，則在發酵培養過程中，發酵液溶氧會先下降然后回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時開始進行補糖。優選地，上述發酵生產尼莫克汀的方法中，發酵使用的菌株為藍灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp. Noncyanogenus)。本發明優選的發酵實施過程是，在發酵罐中發酵培養藍灰鏈霉菌，控制發酵罐的溫度為27-29°C，壓力為O. 04-0. 06Mpa ;根據發酵液的溶氧狀況控制通氣與轉速，設發酵液初始溶氧為100%，在培養過程中要確保發酵液溶氧在30%以上(例如通氣為O. 5-1VVM,轉速為120-250rpm);并在培養過程中流加氨水和稀硫酸以控制pH在6. 0-7. 5 ;溶氧在發酵培養開始后持續下降，然后開始回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，開始間歇或連續補加糖類物質，使總糖濃度維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間，發酵280h之后且當菌濃(PMV，取IOml發酵液3000rpm離心20min，計算固形物體積占發酵液體積的比例)降至15%以下時停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可停止發酵，收獲產物。現有技術在發酵生產尼莫克汀的程中普遍沒有連續補糖或間歇補糖操作。本發明的方法在發酵過程中連續補加或間歇補加高濃度單糖、二糖或多糖溶液，與目前工藝相比可提高發酵產量50%以上，且操作方法簡單易行，原材料來源廣泛，價格低廉，適用于工業化生產，能夠很大程度提高生產水平，降低成本。
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細說明本發明，但不以任何方式限制本發明的范圍。以下具體實施例中所需補加的糖溶液的配制方法、種子培養基及發酵培養基的配制方法均如下補加糖溶液的配制配制300_600g/L的單糖、二糖或多糖單獨或混合溶液，118°C滅菌20min待用。種子培養基葡萄糖20g/L，糊精10g/L，黃豆餅粉20g/L，棉籽餅粉15g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂 lg/L，磷酸氫二鉀 O. 5g/L，pH6. 5。發酵培養基葡萄糖45g/L，乳糖20g/L，黃豆餅粉20g/L，棉籽餅粉15g/L，硝酸鈉O.5g/L,硫酸鎂lg/L,硫酸亞鐵氨0. 66g/L,氯化鎳O. 03g/L,碳酸韓4g/L, pH6. 8。葡萄糖和乳糖與其他不含碳源的物質分開滅菌。實施例I 500L發酵罐發酵過程中的間歇補料在50L種子罐中配制30L種子培養基，120°C滅菌30min后冷卻至27_29°C，按O. 5% (體積比)接種量接入48h種齡的搖瓶種子，然后27-29°C培養28_36h。在500L發酵罐中配制350L發酵培養基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按5% (體積比)接種量接入培養好的種子培養基，發酵過程中控制溫度在27-29°C，控制壓力在O. 04-0. 06Mpa，根據溶氧狀況控制通氣與轉速，以確保溶氧在30%以上(設發酵罐初 始溶氧為100% )，通氣控制在O. 5-1VVM，轉速控制在120-250rpm，培養過程中流加氨水和10%稀硫酸控制pH在6. 0-7. 5之間。將發酵罐初始溶氧設定為100%，溶氧在發酵培養開始后持續下降，8_16h左右降至最低點，24h-48h左右開始回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，每次補加相當于葡萄糖溶液與發酵液質量體積比為2%的500g/L葡萄糖溶液使總糖維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間。發酵300h左右停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可放罐，測定最后發酵單位在 2. 95g/L。實施例2 5000L發酵罐發酵過程中的連續補料在500L種子罐中配制300L種子培養基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按O. 5% (體積比)接種量接入48h種齡的搖瓶種子，然后27-29°C培養28_36h。在5000L發酵罐中配制3500L發酵培養基，120°C滅菌30min后冷卻至27-29°C，按5% (體積比)接種量接入種子培養基，發酵過程中控制溫度在27-29°C，控制壓力在
O.04-0. 06Mpa，根據溶氧狀況控制通氣與轉速以確保溶氧在30%以上(設發酵罐初始溶氧為100% )，通氣控制在O. 5-1VVM，轉速控制在90-180rpm，培養過程中流加氨水和10 %稀硫酸控制pH在6. 0-7. 5之間。將發酵罐初始溶氧設定為100%，溶氧在發酵培養開始后持續下降，8-16h左右降至最低點，24h-48h左右開始回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，以適當流速流加500g/L乳糖與麥芽糖比例I : I混合溶液使總糖維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間。發酵300h左右停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下即可放罐，測定最后發酵單位在3. 24g/L。
權利要求
1.一種發酵生產尼莫克汀的方法，在發酵生產尼莫克汀的過程中，當發酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發酵液間歇或連續補加糖類物質，使發酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發酵。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述糖類物質選自單糖、二糖和多糖中一種或多種。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述單糖是葡萄糖和/或果糖。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述二糖是乳糖、蔗糖和/或麥芽糖。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述多糖是可溶性淀粉、糊精和/或麥芽糊不目ο
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述糖類物質配制為300-600g/L的糖溶液，然后間歇補加或連續補加到發酵液中。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，設定發酵液的初始溶氧為100%，在發酵培養過程中，發酵液溶氧先下降然后回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時開始補加糖類物質。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，發酵使用的菌株為藍灰鏈霉菌。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在發酵罐中發酵培養藍灰鏈霉菌，控制發酵罐的溫度為27-29°C，壓力為O. 04-0. 06Mpa ;根據發酵液的溶氧狀況控制通氣與轉速，設發酵液初始溶氧為100%，在培養過程中要確保發酵液溶氧在30%以上；并在培養過程中流加氨水和稀硫酸控制PH在6. 0-7. 5 ;溶氧在發酵培養開始后持續下降，然后開始回升，當發酵液溶氧回升至70%以上且總糖濃度低于30g/L時，開始間歇或連續補加糖類物質，使總糖濃度維持在10-40g/L，同時溶氧恢復并介于40-70%之間，發酵280h之后當菌濃降至15%以下時停止補糖，當溶氧升至90%以上且總糖降至10g/L以下停止發酵，收獲產物。
全文摘要
本發明公開了一種發酵生產尼莫克汀的方法。在發酵生產尼莫克汀的過程中，當發酵液中的總糖濃度低于30g/L時，通過向發酵液間歇或連續補加糖類物質，使發酵液中的總糖濃度維持在10-40g/L進行發酵生產。該方法使尼莫克汀發酵單位提高50％以上，同時，生產操作簡單，對設備要求低，成本較低，是一種適用于工業化生產的工藝。
文檔編號C12R1/465GK102952832SQ20111024285
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者別一, 趙德, 劉會明 申請人:北大方正集團有限公司, 北大國際醫院集團重慶大新藥業股份有限公司, 北大國際醫院集團有限公司