專利名稱：氯霉素抗性溫控裂解質粒及其構建與在菌蛻制備中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種質粒載體，特別涉及一種氯霉素抗性溫控裂解質粒及其構建方法，以及其在制備大腸桿菌菌蛻中的用途，屬于基因工程領域。
背景技術：
細菌菌蛻(Bacterial ghost)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E 裂解后形成的完整細菌空殼，這種非變性的基因滅活方式使菌蛻保留了和活菌一樣的細菌胞膜結構和相關抗原蛋白，從而誘導機體的體液免疫和細胞免疫應答。菌蛻外膜的天然的高度保守結構 PAMP (pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、妝聚糖、 CPG、菌毛等，能被免疫細胞通過模式識別受體識別，有效地被樹突狀細胞和巨噬細胞吞噬， 并有效地促進樹突狀細胞的成熟和活化。菌蛻的這些生物學特點使其可直接作為疫苗使用，還可作為遞呈異源抗原的重組疫苗及作為DNA疫苗甚至藥物的遞送載體。另外，菌蛻可以通過發酵方式生產，且冷凍干燥的菌蛻在室溫下可長期保持，而不會造成效率的損失。細菌菌蛻的形成是通過對噬菌體PhiX174的裂解基因E的嚴格表達調控實現的。 裂解基因E可以受控于多個表達系統，如ApL/pR-cI857, LacPO-LaclH啟動與阻隔物)、 PTol-xylS以及PBAD_araC等，其中應用最廣泛的是在λ pL/pR_cl857轉錄控制下實現基因的可控表達。基因E的可控表達介導的細菌裂解已經成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、遲鈍愛德華菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌等。 應用范圍之廣說明只要將基因E裂解框引入到適當的載體中，E蛋白介導的裂解可能會在每種革蘭氏陰性菌中發生。目前已經構建的基因E介導的裂解質粒多數利用氨芐青霉素作為抗性篩選標記， 還有一些具有卡那霉素、四環素或慶大霉素抗性篩選標記。由于細菌耐藥性現象越來越常見，許多細菌對氨芐青霉素、卡那霉素等常用抗生素產生耐藥，無法利用這些抗生素作為篩選標記。但許多病原菌如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌0157、變形桿菌、沙門菌、志賀菌等均對氯霉素敏感，還有大多數水生生物病原菌如柱狀嗜纖維菌、 柱狀粘纖維菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌及魯克氏耶爾森氏菌等均對氯霉素敏感或者高度敏感。因此，利用氯霉素作為抗性篩選標記能使E蛋白介導的裂解應用到更廣泛的細菌菌株中。構建氯霉素抗性的溫控裂解質粒是許多病原菌能夠成功形成菌蛻的前提。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種新的氯霉素抗性溫控裂解質粒，并提供了其構建方法，以及其在菌蛻制備中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat，由噬菌體PhiX174裂解基因E (如SEQ No. 3所示)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat，如SEQ No. 4所示)和原核溫控表達載體 PBV220 組成。所述氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的構建方法為以卩遼菌體PhiX174 RFI DNA為模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA為引物進行PCR擴增，獲得噬菌體PhiX174 裂解基因E，然后將其與經EcoR I和Pst I雙酶切的pBV220載體連接，獲得溫控裂解質粒 pBV-geneE ;將質粒pLysS經Acc II酶切，獲得1787bp的包含側翼調控序列的cat基因，然后用T4 DNA Iigase將cat基因與經Sca I單酶切的pBV-geneE進行連接，獲得氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat。所述氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat能夠用于制備菌脫,具體應用方式舉例如下將氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat電擊轉化到大腸桿菌感受態細胞中；電轉化后涂布含氯霉素的LB瓊脂平板，培養，通過菌落PCR鑒定轉化子；然后，將轉化成功的含pBV-geneE-cat的大腸桿菌單克隆接種于含氯霉素的LB液體培養基，振蕩培養， 然后再轉接于含氯霉素的LB液體培養基中，振蕩培養至OD6tltol達O. 4-0. 6，將培養物迅速調至42°C培養以誘導E基因的表達，繼續培養，即得大腸桿菌菌蛻。上述制備菌蛻的方法具體如下將氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat電擊轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，所述的電轉化感受態細胞購自TaKaRa，或是參照Sambrook等的方法(分子克隆實驗指南)制備，電轉化儀(Bio-Rad, California, USA) 的電擊參數為1. 5kV/cm、25 μ F、200 Ω、4· Oms,電轉化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板，30°C培養16小時，通過菌落PCR鑒定轉化子。將含pBV-geneE-cat的BL21(DE3) 單克隆接種于5mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養基，30°C振蕩(200r/min)培養過夜， 然后按1-2% (v/v)轉接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養基中，30°C振蕩培養至 OD600nm達O. 4-0. 6。將培養物迅速調至42°C培養以誘導E基因的表達，繼續培養4h，即得大腸桿菌菌蛻。本發明構建的氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat能夠在對氯霉素敏感的大腸桿菌中穩定存在，且能夠誘導其發生較高效率的裂解，成功制備大腸桿菌菌蛻，裂解效率可高達99. 998%。本發明構建的氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat,可以在大腸桿菌中穩定的復制，并能夠高效表達氯霉素乙酰轉移酶，從而產生氯霉素抗性，以此來作為抗性篩選標記，適用于多數病原菌，如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌0157、 變形桿菌、沙門菌、志賀菌、柱狀嗜纖維菌、柱狀粘纖維菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌及魯克氏耶爾森氏菌等，應用廣泛，且可高效表達裂解基因E，制備的菌蛻裂解效率高，可達99. 998%。


圖I :本發明構建氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的流程示意圖；圖2 :含氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的大腸桿菌BL21 (DE3)的裂解動力學曲線；圖3 :大腸桿菌BL21 (DE3)菌蛻的透射電鏡照片。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步闡釋本發明，本發明構建的氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的結構特征和優勢將隨著描述而更為清晰。下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。試驗材料質粒PBV220、質粒pLysS、菌株BL21 (DE3)為本實驗室保存； Enterobacteria phage phiX174 RFI DNA,限制性內切酶，T4DNA ligase, PCR 相關試劑， Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit,TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 均購于購于TaKaRa寶生物(工程)大連有限公司；引物合成與測序由華大基因(BGI)完成。實施例I、氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的構建I. lPhiX174裂解基因E的克隆根據GenBank中PhiX174基因E的編碼序列設計引物geneE-F :5’ -ATCAGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3’ (SEQ No. I)，引入 EcoR I 限制性酶切位點；geneE-R 5，~GGCCTGCAGCAGAACGTTTTTTACCTTTAG~3，(SEQ No. 2)，引入 Pst I 限制性酶切位點。引物由華大基因合成。以PhiX174RFIDNA為模板通過PCR擴增基因E。PCR反應體系為 TaKaRa Ex Taq I. 2U, IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y L, PhiX174RFI DNA2ng, geneE-F (20 μ M) I μ L, geneE-R (20 μ Μ) I μ L，補水到 50 μ L0 PCR 反應程序為 94°C預變性 5min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 40s，28 個循環，72°C延伸lmin。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約300bp的片段，用EcoR I和Pst I進行雙酶切，回收酶切產物，獲得geneE。12溫控裂解質粒pBV-geneE的構建質粒pBV220經EcoR I和Pst I雙酶切，酶切反應體系為EcoR I 10U、Pst I 10U、 IOXH Buffer 2 μ L、pBV2200. 8 μ g、補水至20μ L，37°C酶切lh，回收酶切產物，獲得線性化pBV220。將線性化pBV220與geneE連接，連接反應體系為T4DNA ligase 350U、geneE 0.4pmol、pBV O. 03pmol、10XT4DNALigase Buffer 2· 5 μ L，補水至 25 μ L，16°C連接 12h， 并熱擊轉化入大腸桿菌DH5 α。轉化的DH5 α先在無氨芐青霉素的LB液體培養基中30°C、 180r/min條件下振蕩培養lh，然后將其涂布在含有氨芐青霉素50 μ g/ml的LB平板上， 30°C培養16h。通過菌液PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定?；駿序列正確的轉化子進行增菌培養，提取質粒，命名為pBV-geneE。I. 3氯霉素乙酰轉移酶基因cat平末端片段的獲得質粒pLysS經AccII 單酶切，酶切體系為 Acc II 10U、10XM Buffer 2 μ L>pLysS 0. 6μ g、補水至20μ L，37°C酶切lh。瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，切膠回收約1800bp條帶， 獲得包含啟動子區的氯霉素乙酰轉移酶基因cat片段。14pBV-geneE線性化平末端片段的獲得質粒pBV220_geneE 經 Sca I 酶切，酶切體系為 Sca I 10UU0XH Buffer 2 μ L、 PBV2200. 8 μ g、補水至20 μ L，37°C酶切Ih。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收約3. 6kb條帶，獲得pBV-geneE線性化平末端片段。
I. 5pBV_geneE_cat 質粒的構建將cat基因片段憐酸化處理，反應體系為T4polynucleotide Kinase 12U、cat 10pmol、5 μ L10XT4 Polynucleotide Kinase Buffer、補水至 50 μ L, 37 °C 處理 lh。將線性化質粒pBV-geneE去磷酸化，反應體系為Alkaline Phosphatase 4U、線性化質粒 pBV-geneE 15pmoIUO X SAPBuffer 5 μ L，補水至 50 μ L，37°C處理 lh。用T4 DNA ligase連接去磷酸化的pBV-geneE片段與磷酸化的cat片段,連接反應體系為T4DNAligase 350U、憐酸化cat片段04pmol、去憐酸化pBV-geneE片段O. 03pmol、 10XT4DNA Ligase Buffer 2· 5 μ L、補水至25 μ L，16°C反應12h。將連接產物通過熱擊轉化入大腸桿菌DH5a。通過氯霉素和菌液PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定?；駿和基因 cat的序列均正確的轉化子進行增菌培養,提取質粒,命名為pBV-geneE-cat。上述構建氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的流程示意圖如圖I所示。實施例2、質粒pBV-geneE-cat轉化大腸桿菌BL21 (DE3)制備菌脫2. I氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的電轉化將氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat電擊轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，所述的電轉化感受態細胞購自TaKaRa,參照Sambrook等的方法(分子克隆實驗指南)制備，電轉化儀(Bio-Rad, California, USA)的電擊參數為I. 25kV/cm、25 μ F、200 Ω、 6. 0ms,電轉化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板，30°C培養16小時，通過菌落PCR
鑒定轉化子。將含氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的BL21 (DE3)單克隆接種于5mL含 371^/1^氯霉素的1^液體培養基，301振蕩(200r/min)培養過夜，然后按I % (v/v)轉接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養基中，30°C振蕩培養至OD6tltlnm達0. 4-0. 6。將培養物迅速調至42°C培養以誘導E基因的表達，繼續培養4h。誘導前后不同時間點取樣，監測培養物的OD6tltlnm和活菌CFU變化，活菌CFU通過將誘導前后的培養物各100 μ L適當稀釋后涂布LB平板進行計數。誘導結束后形成的ghost菌蛻用PBS洗滌3次，凍干保存，并對凍干后的菌蛻進行活菌CFU檢測。質粒pBV-geneE-cat誘導BL21 (DE3)裂解的動力學曲線見圖2。升溫誘導30min 后，BL21(DE3)培養物的0D_和活菌CFU均快速降低，隨后緩慢降低至最低水平。誘導前培養物的活菌數為3. 45X 107CFU/mL，誘導結束時培養物的活菌數為5. 26 X 102CFU/mL,該質粒的裂解效率達99. 998%。凍干后的菌蛻未檢測到活菌。試驗例I、大腸桿菌BL21(DE3)菌蛻的透射電鏡觀察將實施例2中42°C誘導4h的菌液4000g離心lOmin，用2. 5%戊二醛4°C下固定細菌3h，0.01mol/LPBS洗滌3次，離心后直接電鏡觀察。結果見圖3。
權利要求
1.一種氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat，其特征在于由噬菌體PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰轉移酶基因和原核溫控表達載體pBV220組成。
2.權利要求I所述的氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的構建方法,其特征在于以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA為引物進行PCR擴增，獲得噬菌體PhiX174裂解基因E，然后將其與經EcoR I和Pst I雙酶切的pBV220載體連接，獲得溫控裂解質粒pBV-geneE ;將質粒pLysS經Acc II酶切，獲得1787bp的包含側翼調控序列的cat基因，然后用T4DNA Iigase將cat基因與經Sca I單酶切的pBV-geneE 進行連接，獲得氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat。
3.權利要求I所述的氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat在制備菌脫中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于制備菌蛻的方法如下將氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat電擊轉化到大腸桿菌感受態細胞中；電轉化后涂布含氯霉素的LB 瓊脂平板，培養，通過菌落PCR鑒定轉化子；然后,將轉化成功的含pBV-geneE-cat的大腸桿菌單克隆接種于含氯霉素的LB液體培養基，振蕩培養，然后再轉接于含氯霉素的LB液體培養基中，振蕩培養至OD6tltlnm達0. 4-0. 6，將培養物迅速調至42°C培養以誘導E基因的表達， 繼續培養，即得大腸桿菌菌蛻。
全文摘要
氯霉素抗性溫控裂解質粒及其構建與在菌蛻制備中的應用。本發明公開了一種氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat及其構建方法，還公開了該質粒pBV-geneE-cat在大腸桿菌Ecoli.BL21(DE3)菌蛻制備中的應用。本發明氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat由噬菌體PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)和原核溫控表達載體pBV220組成。本發明構建的質粒pBV-geneE-cat可以在大腸桿菌中穩定的復制，并能夠高效表達氯霉素乙酰轉移酶，從而產生氯霉素抗性，以此來作為抗性篩選標記，還可高效表達裂解基因E，在制備氯霉素敏感的大腸桿菌菌蛻時裂解效率可達99.998％。
文檔編號C12N15/66GK102586307SQ20121005357
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者安利國, 楊桂文, 祝文興, 袁金鐸 申請人:山東師范大學