專利名稱：一條編碼adi的優(yōu)化dna分子及表達(dá)adi的工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一條編碼ADI的優(yōu)化DNA分子及含有所述優(yōu)化DNA分子的工程菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-精氨酸是哺乳動物細(xì)胞很重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它也被支原體用作主要的非糖酵解能量來源。從被支原體感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中得到的精氨酸脫亞胺酶(Aiginine deiminase, ADI, EC 3.5.3.6)能夠降解精氨酸為瓜氨酸和氨水，該酶存在于很多種類的微生物中，ADI 已被證明能夠抑制腫瘤細(xì)胞體外生長以及具有抗血管生成的活性。人體正常細(xì)胞能夠通過瓜氨酸透過胞質(zhì)酵素精氨基琥珀酸合成酶(ASS)及精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)合成精氨酸。精氨酸的代謝途徑已被很好地描述，在膳食攝取中，精氨酸從肝門靜脈被肝吸收，并通過精氨酸酶迅速轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，在后一過程中，形成尿素，從精氨酸產(chǎn)生的鳥氨酸然后轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，或者可被代謝為谷氨酸鹽/酯和丙氨酸，或者形成的鳥氨酸摻入多胺化合物，例如，腐胺。未被代謝為鳥氨酸的膳食精氨酸可被加工為例如精氨酰-tRNA，用于蛋白合成。此外，存在通向精氨酸的內(nèi)源合成途徑，后一過程主要在腎臟中發(fā)生，其中從鳥氨酸和瓜氨酸前體合成精氨酸。人形支原體M. arginini游ADI是一種能夠降解精氨酸的酶，其由arcA基因編碼，蛋白總量占I arginini可溶蛋白的10%，除了支原體I arginini以外，其它許多微生勉擬Mycoplasma hominis、Mycoplasma artkritidis、Mycobacterium tuberculosis、 Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都編碼ADI，后者催化精氨酸代謝為生物體提供能量。M. arginini編碼的ADI是由410個氨基酸組成的球型生物大分子，分子量約為 46000，等電點(diǎn)為4. 7，沒有分子內(nèi)二硫鍵，以二聚體形式出現(xiàn)。氨基酸降解酶能通過解除胞外相關(guān)氨基酸的供給來抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖。人體部分腫瘤細(xì)胞缺乏精氨酸合成的相關(guān)酶，不能合成精氨酸(Cancer Res 62:5443-5440), 屬于精氨酸營養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞，這種不能表達(dá)精氨基琥珀酸合成酶的性質(zhì)最近被科研人員所證實(shí)(Shen L J，Lin W C, Beloussow K, Shen W C. 2003)。肝癌、乳腺癌、黑素瘤等腫瘤是人體常見腫瘤，研究表明，這些腫瘤多是精氨酸營養(yǎng)缺陷型，這些腫瘤的細(xì)胞往往不能合成精氨酸，必須依賴外界的精氨酸來維持細(xì)胞的生長繁殖，而人體正常細(xì)胞是能夠自身合成精氨酸的。因此，通過ADI降解血液循環(huán)中的精氨酸，精氨酸的營養(yǎng)缺陷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，進(jìn)而達(dá)到治療腫瘤的效果。ADI能有效抑制精氨酸缺陷型腫瘤，如黑素瘤和肝細(xì)胞癌(HCC)的增殖。同時， ADI還能誘使人類白血病細(xì)胞的凋亡，抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管增生。1970年，Gill等人最先報道了從支原體分離得到的ADI能抑制小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞的分裂(Gill P, Pan J, 1970，16(6) :415—419)。小鼠體內(nèi)研究表明，ADI注射在抑制黑素瘤和HCC實(shí)驗(yàn)鼠中是有效的(Takaku H, Takase M, 1992, 51 (2) :244-249)0然而，ADI用作常規(guī)抗腫瘤藥物卻因其低效性而受到限制，而這是由ADI作為一種微生物活性酶，在哺乳動物中具強(qiáng)抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長活性和較短的血清半衰期引起的。經(jīng)20 KD PEG修飾ADI-PEG-20(ADI-SS PEG20, 00 mw)和天然ADI在體外對黑素瘤和HCC細(xì)胞一樣有效。1999年ADI-PEG-20，即PEG化重組支原體ADI被FDA指定為美國罕見病藥物，用于治療惡性黑素瘤和HCC。目前正在全球范圍進(jìn)行治療黑色素瘤和原發(fā)性肝癌的II期和III期臨床試驗(yàn)。目前ADI在大腸桿菌中的高效重組表達(dá)仍然存在一定問題。盡管已有眾多微生物可編碼精氨酸脫酰酶，但在用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ADI時，由于宿主菌目的蛋白普遍都存在表達(dá)量低的問題，一般宿主菌目的蛋白表達(dá)量在20%以下，目的蛋白表達(dá)量相對較高的如張希東，李捷雷等(張希東，李捷雷，張洪義，等.精氨酸脫亞胺酶的表達(dá)、純化和活性研究 [J].中國生物工程雜志.2008，觀(6):42、7.)在研究精氨酸脫亞胺酶的表達(dá)中，通過人工合成編碼支原體精氨酸脫亞胺酶的基因，構(gòu)建PBV220-ADI原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5ci中并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，目的蛋白的表達(dá)量可達(dá)到30%以上。由于表達(dá)量低的問題，這嚴(yán)重制約著ADI的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)展，因此，尋找可高效表達(dá)精氨酸脫亞胺酶的工程菌，以解決表達(dá)量低的問題，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員一直渴望解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明文本中，字母ADI用來表示精氨酸脫亞胺酶蛋白，表示蛋白ADI的表達(dá)基因。本發(fā)明的目的在于提供一條ADI編碼基因的大腸桿菌密碼子優(yōu)化DNA分子adi, 其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。本發(fā)明選用ai/i序列來源于人形支原體Mycoplasma hominis ATCC 23114全長1227個bps，共編碼409個氨基酸，分子量為46313Da，等電點(diǎn)為 5 · 22ο本發(fā)明中，在優(yōu)化基因時，通過優(yōu)先突變基因在大腸桿菌中表達(dá)的稀有密碼子選擇五COli表達(dá)的最優(yōu)密碼子，并將攜帶優(yōu)化的3辦基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主菌后。通過序列優(yōu)化，全基因合成ai/i序列，優(yōu)化的ai/i只含有1個損ol和Mfe I酶切位點(diǎn)， 與表達(dá)載體連接后，ADI表達(dá)量占全菌總蛋白30%以上，優(yōu)選35%以上。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有本發(fā)明優(yōu)化DNA分子的表達(dá)載體，表達(dá)載體選用PET系列表達(dá)載體，采用帶有T7啟動子的高表達(dá)pET系列載體作為目的蛋白表達(dá)載體，構(gòu)建的表達(dá)載體為pET30a-ai/i。本發(fā)明所構(gòu)建的含優(yōu)化adi序列的表達(dá)載體pET30a-ai/i，誘導(dǎo)后幾小時目標(biāo)產(chǎn)物就可超過細(xì)胞總蛋白的30%，達(dá)到高效表達(dá)的目的，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的又一目的在于提供一株高效表達(dá)ADI的大腸埃希氏菌，所述大腸埃希氏菌是將構(gòu)建的表達(dá)載體pET30a-ai/i轉(zhuǎn)染至五coli BL21 (DE3)宿主菌中，轉(zhuǎn)染至大腸桿菌后在含卡那抗性的LB平皿中帥選獲得，該菌株已保藏至中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2011年08月22日，建議的分類名為大腸埃希氏菌fecAericAia cWi，保藏編號為 CGMCC No. 5159。本發(fā)明的還一目的在于提供一種本發(fā)明所述的優(yōu)化ai/i序列、以及含有本發(fā)明所述的優(yōu)化的adi序列的表達(dá)載體pET30a-ai/i、和含有本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pET30a-ai/i的大腸埃希氏菌在生產(chǎn)制備精氨酸脫亞胺酶中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，給出了篩選本發(fā)明工程菌菌種的方法，通過篩選高表達(dá)量的陽性轉(zhuǎn)化子，并將奪得的高表達(dá)量的陽性轉(zhuǎn)化子(工程菌)進(jìn)行保藏，其保藏編號為 CGMCC No. 5159。本發(fā)明的再一實(shí)施例中，給出了利用本發(fā)明工程菌發(fā)酵生產(chǎn)ADI的工藝， pET30a-ai/i/BL21 (DE3)工程菌表達(dá)的ADI占全菌比例高達(dá)46. 46%，高于目前已知文獻(xiàn)中報道的表達(dá)量(約35%)。本發(fā)明的還一實(shí)施例給出了提取純化本發(fā)明工程菌所得ADI的方法，通過破菌、 包涵體洗滌和抽提、復(fù)性和精制步驟，最終所得ADI的純度可達(dá)98%以上，比活可大于110 IU/mg。本發(fā)明的還一實(shí)施例中，給出了驗(yàn)證本發(fā)明菌種遺傳穩(wěn)定性的研究，本發(fā)明所得工程菌具有遺傳穩(wěn)定性，其質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性至少可維持7天。本發(fā)明構(gòu)建的ADI高效表達(dá)工程菌，ADI表達(dá)量高，占全菌總蛋白40%以上，優(yōu)選 45%以上，更優(yōu)選50%以上，所得ADI經(jīng)純化后，比活性高，37°C下測定，ADI比活可到110 IU/mg,并且，所構(gòu)建的工程菌遺傳穩(wěn)定，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)制備ADI。


圖1為表達(dá)載體pET30a-ai/i構(gòu)建技術(shù)路線圖。 圖2為ai/i與pET30a連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物PCR篩選在1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)用上電泳檢測各個樣品擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中(Γ5泳道未菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中0為陰性對照，M為Marker 2000 Plus, 1為1號轉(zhuǎn)化子，2為2號轉(zhuǎn)化子，3為3號轉(zhuǎn)化子，4為4號轉(zhuǎn)化子，5為5號轉(zhuǎn)化子。圖3為陽性轉(zhuǎn)化子酶切鑒定結(jié)果圖，其中泳道M1為λ /Hind III Marker，泳道1 為pET30a-ai/i質(zhì)粒，泳道2為pET30a_ai/i良Nde I和損ο I雙酶解后圖，泳道3為pET30a 經(jīng)Nde I酶解電泳圖，泳道4為序列adi經(jīng)Nde \~Xho I雙酶切電泳圖，泳道5為pET30a 質(zhì)粒電泳圖，泳道6為pMD18TS-ai/i質(zhì)粒電泳圖，泳道Mtl為DL2000+II。圖4為ADI工程菌篩選圖，各菌誘導(dǎo)表達(dá)前后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測圖，其中圖 4A中廣3為ADI Γ3號轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后全菌，4飛為ADI廣3號轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)前全菌；圖4B中廣3為ADI 4飛號轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后全菌，4飛為ADI 4飛號轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)前全菌。圖 5 為工程菌 pET30a-ai/i/BL21 (DE3) ADI 表達(dá)情況，泳道 1 為 pET30a_ai/i/ BL21 (DE3)工程菌誘導(dǎo)前全菌，泳道2為誘導(dǎo)后全菌，泳道3為超聲上清，泳道4為包涵體， 泳道M為蛋白Marker。
具體實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)材料 adi的全序列及ai/i擴(kuò)增引物
委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司全序列合成SEQ ID No:l中優(yōu)化的序列，并克隆至PMD18-T simple載體，獲得含有at/i序列的載體pMD18_T simple-at/i。委托生工生物(上海)有限公司合成adi的PRC擴(kuò)增引物。
權(quán)利要求
1.一條編碼精氨酸脫亞胺酶的優(yōu)化DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
2.一種表達(dá)載體pET-30a-ADI，其特征是所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的 DNA分子序列。
3.含有權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的大腸埃希氏工程菌pET-30a-ai/i/BL21(DE3)，其保藏編號為 CGMCC No. 5159。
4.權(quán)利要求1所述優(yōu)化DNA分子在生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體在生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的工程菌在生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶中的應(yīng)用。
7.一種精氨酸脫亞胺酶的制備方法，包括選取工程菌菌株pET-30a-ai/i/BL21(DE3)， 轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液經(jīng)破菌、包涵體洗滌以及抽提、復(fù)性和精制步驟，得到目的蛋白精氨酸脫亞胺酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，在培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑IPTG后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所述破菌為超聲破菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述精制步驟是采用柱層析精制。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用柱層析為離子交換柱或分子篩中的任意一種或組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一條編碼精氨酸脫亞胺酶的優(yōu)化DNA分子，以及含有所述的優(yōu)化DNA分子的表達(dá)載體pET-30a-ADI，和含有所述表達(dá)載體的工程菌pET-30a-adi/BL21(DE3)，其保藏編號為CGMCCNo.5199，本發(fā)明所述的工程菌菌株，具有高效表達(dá)精氨酸脫亞胺酶的效果，其表達(dá)率高達(dá)40%以上，純化后比活在37℃可達(dá)110IU/mg。
文檔編號C12N1/21GK102321643SQ20111028284
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者侯建華, 楊璐 申請人:北京凱因科技股份有限公司