專利名稱：一種大腸埃希桿菌o157∶h7基因組dna作為pcr標準物質的制備方法
技術領域：
一種大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，屬于生物學技術領域。
背景技術：
大腸埃希桿菌0157 H7廣泛存在于自然界中，是一種重要的人畜共患病致病菌， 人被感染后常引起嚴重腹瀉和敗血癥，嚴重的可引起溶血性尿毒綜合征(HUQ、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)，其中并發HUS和TTP者死亡率高達80%左右，因此，如何控制大腸埃希桿菌0157 H7的感染是目前公共衛生學中的重要課題，對大腸埃希桿菌0157 H7 的快速、準確檢驗是保證人類健康的必要手段。傳統的檢測細菌的方法包括了生化培養、分離鑒定，檢驗程序復雜繁瑣，報告檢驗結果大致需4 7d，耗時太長，而且檢測靈敏度低。隨著分子生物學的發展，PCR技術已廣泛應用于食品微生物、動植物疫病、飼料成分及轉基因成分的檢測領域，使食源性致病菌的快速檢驗發展到一個嶄新的高度。本發明提供一種大腸埃希桿菌0157 H7 PCR檢測中陽性標準物質的制備方法，使PCR的檢測結果更加確鑿。

發明內容
本發明的目的是提供一種提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR 標準物質的制備方法，以便使PCR樣品的檢測結果更加準確。本發明的技術方案一種提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR 標準物質的制備方法，利用羧基化的磁性納米粒子提取了大腸埃希桿菌0157:H7基因組 DNA ；大腸埃希桿菌0157 H7已為下列文獻公開，文獻1 [Food Microbiology 23 (2006) 162 - 168. The use of Fourier transform infrared spectroscopy to differentiate Escherichia coli 0157:H7 from other bacteria inoculated into apple juice ；Murad A. Al-Holya, Mengshi Linb, Anna G. Cavinatoc, Barbara A. Rascob]；
文獻2: [Food Research International 39 (2006) 98 - 105. Inactivation of food spoilage bacteria and Escherichia coli 0157:H7 in phosphate buffer and orange juice using dynamic high pressure ；Imane Tahiri, Joseph Makhlouf 氺，Paul Paquin, Ismail Fliss].
(1)大腸埃希桿菌0157 H7的培養
按傳統培養方法對大腸埃希桿菌0157 H7進行增菌培養；
(2)表面羧基化的磁性納米粒子的制備
制備羧基修飾的磁性納米粒子，用于吸附大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA;
(3)病原微生物大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA的提取；(4)用步驟(2)得到的大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA過kphadex G-200分離柱進行分離純化；
(5)用步驟(4)得到的純化后的大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA測定ICP-MS計算濃度；
(6)將步驟(4)純化后的DNA的PCR擴增產物進行PCR檢測，瓊脂糖電泳檢測大腸埃希桿菌0157 H7的目的條帶。各步驟的操作詳見具體實施例。本發明的有益效果本發明采用羧基化的磁性納米粒子提取了大腸埃希桿菌 0157 :H7基因組DNA，并進行分離純化，電感耦合等離子體質譜ICP-MS測定P元素以確定提取DNA濃度，最終進行PCR擴增，電泳檢測目的條帶明顯，-20°C保存半年性質不變，穩定性高，可以作為大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA的PCR標準物質，以便使PCR樣品的檢測結果更加準確。


圖1 :S印hadex G-200分離純化圖。圖2 基因組DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3 基因組DNA樣品-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明。實施例1.大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA進行粗提； (1)大腸埃希桿菌0157 H7的增菌培養
將大腸埃希桿菌0157 H7菌株，即ATCC 35150，接種在山梨醇麥康凱SMAC平板上， 37°C培養10h，再接一環接種于IOmL改良E. C新生霉素增菌肉湯，于37°C培養10h。(2)磁納米粒子的制備
取0. 65g !^eCl3,0.4g檸檬酸三鈉，20mL乙二醇，攪拌反應lOmin。t取1. 2g醋酸鈉加入上述溶液中，攪拌反應20min，再將上述溶液在230°C下攪拌反應10h。直向上述溶液中加入20mL無水乙醇，超聲lOmin，6000rpm離心lOmin，去上清。向上述沉淀中加入20mL去離子水，超聲lOmin，6000rpm離心lOmin，去上清。f:向上述沉淀中加入5mL去離子水，得到粒徑為350nm的表面羧基化的磁性納米粒子。(3)大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA的提取 ,取大腸埃希桿菌0157 Η7改良Ε. C新生霉素增菌肉湯培養液lmL，IOOOOrpm離心 5min，去除上清。；！將.中沉淀用 ImL TE 緩沖液溶解(50mM Tris-Hcl, IOmM EDTA, pH8. 0)，加入 ΙΟΟμ 10%SDSof向上述溶液中加入20μ (2)中制備的磁納米粒子。向上述溶液中加入370μ 30% (w/v) PEG6000的6mol/L NaCl混合液，室溫下反應15min。f將上述溶液放入磁力架中，去除上清。⑥向上述磁粒子中加入ImL 70%乙醇洗滌。⑦將上述溶液放入磁力架中，去除上清。⑧向上述磁粒子中加入IOOPL TE緩沖液溶解(IOmOTris-HCl，ImM EDTA, pH8. 0)， 65°C反應 lOmin。⑨將上述溶液放入磁力架中，取上清，為粗提取的大腸埃希桿菌0157 H7基因組 DNA。實施例2. S印hadex G-200分離柱進行分離純化分離柱:Sephadex G-200 ；
流動相TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8. 0)； 流速:0. 5mL/min ；
檢測器紫外檢測器(發射波長260nm)； 上樣量提取DNA樣品ImL ；
從6. 5mL處的樣品開始收集分離峰，得到的為純化后的大腸埃希桿菌0157 H7基因組 DNA。實施例3.大腸埃希桿菌0157 H7基因組通過ICP-MS測定P元素濃度來測定 DNA濃度
1)將實施例2中獲得的DNA樣品，用純水在4°C中進行透析48h，去除樣品中的小分子。2)準確量取4mL步驟1)中透析好的樣品于微波消解管中，加濃硝酸6mL，蓋好蓋子，室溫放置過夜，第二天早上放于微波消解儀中消解。待消解完成后放入通風櫥中排酸， 然后將消化液轉移入50mL塑料離心管中，定容至25mL，混勻，然后定重，待測。消解程序如下(表1):
表1樣品消解程序
權利要求
1.一種提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法， 其特征在于利用羧基化的磁性納米粒子提取了大腸埃希桿菌0157:H7基因組DNA ；工藝步驟為(1)大腸埃希桿菌0157 H7的培養按傳統培養方法對大腸埃希桿菌0157 H7進行增菌培養；(2)表面羧基化的磁性納米粒子的制備制備羧基修飾的磁性納米粒子，用于吸附大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA;(3)病原微生物大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA的提取；(4)用步驟(2)得到的大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA過kphadex G-200分離柱進行分離純化；(5)用步驟(4)得到的純化后的大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA測定ICP-MS計算濃度；(6)將步驟(4)純化后的DNA的PCR擴增產物進行PCR檢測，瓊脂糖電泳檢測大腸埃希桿菌0157 H7的目的條帶。
2.根據權利要求1所述的提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，其特征在于大腸埃希桿菌0157 H7的增菌培養大腸埃希桿菌0157 H7 JPATCC 35150，接種在山梨醇麥康凱SMAC平板上，37°C培養 IOh,再接一環接種于IOmL改良E. C新生霉素增菌肉湯，于37°C培養10h。
3.根據權利要求1所述的提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，其特征在于表面羧基化的磁性納米粒子的制備①取0.65g FeCl3,0.4g檸檬酸三鈉，20mL乙二醇，攪拌反應IOmin ；②取1.2g醋酸鈉加入①所得溶液中，攪拌反應20min ；再在230°C下攪拌反應IOh ；③向②所得溶液中加入20mL無水乙醇，超聲10min，6000rpm離心lOmin，去上清；④向③所得沉淀中加入20mL去離子水，超聲10min，6000rpm離心lOmin，去上清；⑤向上述步驟④所得沉淀中加入5mL去離子水，得到粒徑為350nm的表面羧基化的磁性納米粒子。
4.根據權利要求1所述的提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，其特征在于大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA的提取①取大腸埃希桿菌0157 H7改良E. C新生霉素增菌肉湯培養液lmL，IOOOOrpm離心 5min，去除上清；②將①中沉淀用ImLTE緩沖液溶解，加入IOOPL 10%SDS ；所述TE緩沖液為pH 8. 0含 IOmM EDTA 的 50mM Tris-HCl 緩沖液；③向②所得溶液中加入20μ 權利要求1步驟(2)或權利要求3中制備的表面羧基化的磁性納米粒子；④向③所得溶液中加入370μ w/v 30% PEG 6000的6mol/L NaCl混合液，室溫反應 15min ；⑤將④所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑥向⑤所得磁粒子中加入ImL質量濃度70%乙醇；⑦將⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑧向⑦所得磁粒子中加入IOOPLTE緩沖液溶解，65°C反應lOmin，所述TE緩沖液為 pH8. 0 含 ImM EDTA 的 IOmM Tris-HCl 緩沖液；⑨將⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，為粗提取的大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA。
5.根據權利要求1所述的提取純化大腸埃希桿菌0157 H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，其特征在于采用kphadex G-200分離柱進行分離純化 分離柱Sephadex G-200 ；流動相=TE緩沖液為ρΗ8· 0含ImM EDTA的IOmM Tris-HCl緩沖液； 流速:0. 5mL/min ；檢測器紫外檢測器，發射波長260nm ； 上樣量提取DNA樣品ImL;從6. 5mL處的樣品開始收集分離峰，得到的為純化后的大腸埃希桿菌0157 H7基因組 DNA。
全文摘要
一種大腸埃希桿菌O157∶H7基因組DNA作為PCR標準物質的制備方法，屬于生物學技術領域。本發明采用羧基化的磁性納米粒子提取了大腸埃希桿菌O157:H7基因組DNA，并進行分離純化，電感耦合等離子體質譜ICP-MS測定P元素以確定提取DNA濃度，最終進行PCR擴增，電泳檢測目的條帶明顯，-20℃保存半年性質不變，穩定性高，可以作為大腸埃希桿菌O157∶H7基因組DNA的PCR標準物質。
文檔編號C12R1/19GK102399774SQ20111028274
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者勇倩倩, 王利兵, 胥傳來 申請人:勇倩倩, 王利兵, 胥傳來